两种气候条件下梯度有机质含量农田黑土纤维素酶和β-葡糖苷酶活性研究

2019-08-30陈一民张锦源焦晓光隋跃宇

土壤与作物 2019年3期

陈一民，徐欣，侯萌，张锦源，周珂，焦晓光，隋跃宇

(1.中国科学院东北地理与农业生态研究所黑土区农业生态重点实验室，黑龙江哈尔滨 150081；2.黑龙江大学农业资源与环境学院，黑龙江哈尔滨 150080)

0 引言

纤维素是植物体的重要组成部分，占植物干重的50%左右[1-2]，是地球上十分重要的生物量，其分解与转化对土壤碳循环具有重要的意义[3]。土壤中的纤维素在纤维素酶的作用下，逐步分解成葡萄糖，为微生物提供碳源，纤维素酶活性可以反映土壤中微生物对纤维素的分解能力[4]。β-葡糖苷酶是纤维素水解过程中催化纤维二糖转化为葡萄糖的酶，其活性直接限制纤维素的水解[2]，并对潜在的微生物酶活性有一定的促进作用[5]。因此，研究纤维素酶活性和β-葡糖苷酶活性，对认识土壤微生物纤维素分解能力以及纤维素分解限制过程具有重要的意义。

土壤酶活性受土壤有机质含量、温度和施肥等多种环境因素的直接影响[6-7]。已有研究表明，纤维素酶和β-葡糖苷酶活性均随土壤有机质含量升高而增强[8-10]，但这些研究大部分都是侧重于纤维素酶和β-葡糖苷酶活性对不同施肥处理造成的土壤有机质梯度的响应，目前关于自然有机质梯度下纤维素酶和β-葡糖苷酶活性与土壤有机质含量之间关系的研究报道较少。温度是影响土壤酶活性的一个重要因子，一般来讲，随温度升高，纤维素酶和β-葡糖苷酶活性也升高[11-12]，但也有研究表明，温度升高对土壤酶活性有抑制作用或无明显作用[13-15]。酶活性对温度响应的研究多集中在森林生态系统[13-15]，在农田生态系统中的研究较少，纤维素酶和β-葡糖苷酶活性在农田生态系统中对温度的响应亟待进一步研究。此外，目前关于施肥对土壤酶活性的影响研究较多，大部分研究表明施肥能够提高土壤酶活性[10,16-17]，如纤维素酶和β-葡糖苷酶[9,17]；但也有一些研究指出，施肥会通过改变土壤理化性质来改变土壤微生物群落结构，进而对土壤酶活性产生一定的抑制作用[9]，长期施用化肥对农田黑土中纤维素酶和β-葡糖苷酶的影响需要进一步明确。我国东北黑土区南北纵跨1 400 km，东西横跨1 600 km，土壤有机质含量变化范围为6.5～128.9 g·kg-1[18]，年均气温变化范围为-2.5 ℃～5.6 ℃，随着黑土有机质含量和温度的变化，有机质含量与温度交互作用对土壤纤维素酶和β-葡糖苷酶活性的影响尚不明确，并且有机质含量-温度-施肥之间的交互作用对纤维素酶和β-葡糖苷酶活性的影响更是鲜有报道。

空间移位方法作为研究气候变化对土壤影响的有效手段，是将土壤移至不同气候条件下，采用相同的种植、施肥和管理模式来凸显气候对土壤过程的影响。本研究在典型黑土带上选取5种有机质含量的农田黑土，通过空间移位的方法分别将其移置在两种气候条件下，设置施肥与不施肥两种施肥水平，用以研究气候-有机质-施肥对农田黑土中纤维素酶和β-葡糖苷酶活性的影响，旨在揭示气候条件和施肥对不同有机质含量农田黑土纤维素酶和β-葡糖苷酶活性的影响，深化对气候变化和施肥条件下农田黑土中碳循环过程的认识。同时，由于土壤酶活性是土壤肥力和质量的评价指标之一[19-21]，本研究通过对土壤酶活性的研究也能深化对气候变化和长期施肥条件下不同有机质含量农田黑土肥力和质量演变的认识，为应对气候变化和施肥所带来的负面效应，实现黑土区农业可持续发展提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验区域概况

试验地分别设置在黑龙江省海伦市中国科学院海伦农业生态实验站(47°27′N，126°56′E)和吉林省德惠市的黑土研究基地(44°12′N，125°33′E)。黑龙江省海伦市属寒温带大陆性季风气候(MAT1.5)，冬季寒冷干燥，夏季温热多雨，年平均气温1.5 ℃，年降水量500～600 mm，年有效积温2 400～2 600 ℃，年均日照时数为2 600～2 800 h，无霜期110～125 d。吉林省德惠市属于中温带大陆性季风气候(MAT4.5)，春季多风干旱，夏季炎热多雨，年平均气温4.5 ℃，降水量550～600 mm，年有效积温2 800 ℃左右，年日照时数2 600～2 700 h，全年无霜期135～140 d。

1.2 试验设计

试验始建于2004年秋季。在海伦、德惠两处试验地分别建立30个1.4 m×1.2 m×1.0 m(长×宽×深度)的小区，小区之间用20 cm厚的砖墙隔开，并在四周覆盖防水布，底部覆盖石英砂，以防止小区之间的水肥互渗。在黑土区选取5个有机质含量的农田黑土，有机质含量分别为16.6 g·kg-1(SOM1.7)、32.0 g·kg-1(SOM3)、50.6 g·kg-1(SOM5)、58.8 g·kg-1(SOM6)和108.9 g·kg-1(SOM11)，土壤基本理化性状见表1。按每层20 cm挖掘1 m深土壤剖面，各层次充分混匀后分别运送至海伦和德惠两地，按原容重依次回填至小区中。试验设不施肥(CK)与施肥(NPK)两个施肥水平，每种有机质含量农田黑土中均设3次重复。

表1 土壤基本理化性质Table 1 Initial soil properties

试验地于2005年5月起种植玉米，每年种植一季，种植品种为当地主栽品种。施肥处理中，肥料种类分别为尿素、磷酸二铵和硫酸钾，施肥量为N 150 kg·hm-2、P2O575 kg·hm-2和K2O 60 kg·hm-2。播种之前，50%氮肥、全部磷肥和钾肥作为基肥施入，剩余50%氮肥在玉米大喇叭口期追肥。采用人工除草及松地的管理模式[15]。

1.3 土壤样品采集

土壤样品采集于2017年玉米收获后，用φ=2 cm的土钻在每个小区内采集0～20 cm土壤，每个小区内采集10个点，充分混匀后装入无菌聚乙烯袋带回实验室，过1 mm筛，存于4 ℃冰箱中，用于土壤纤维素酶和β-葡糖苷酶活性的测定。

1.4 测定方法

纤维素酶活性的测定采用3，5-二硝基水杨酸比色法[4,22-23]，活性以72 h，1 g干土生成葡萄糖毫克数表示。β-葡糖苷酶活性采用对硝基苯-β-D-葡萄糖苷(PNPG)培养-比色法测定[22]，活性以1 h，1 g土壤对硝基酚的毫克数表示。

1.5 数据统计与分析

原始数据采用Excel 2013进行整理，使用SPSS 22.0软件进行统计分析和差异显著性(α= 0.05)检验，使用SigmaPlot 12.5进行绘图。

2 结果与分析

2.1 气候-有机质-施肥对农田黑土纤维素酶活性的影响

两种气候条件下两种施肥处理中5种有机质含量农田黑土中纤维素酶活性变化如图1所示。MAT4.5条件下，土壤纤维素酶活性在2.56～3.67 mg·kg-1·72 h-1之间，MAT1.5条件下，土壤纤维素酶活性在1.35～3.47 mg·kg-1·72 h-1之间。除SOM1.7外，施肥与不施肥处理中各农田黑土土壤纤维素酶活性在MAT4.5条件下显著高于MAT1.5条件下，并且在不施肥处理中，随着有机质含量的升高，纤维素酶活性差异减小，但在施肥处理中随有机质含量升高纤维素酶活性差异逐渐增大。两种气候条件下，土壤纤维素酶活性随土壤有机质含量无明显变化规律。施肥对不同气候条件下土壤纤维素酶活性的影响不同，MAT4.5条件下施肥能大幅度提高土壤纤维素酶活性，增加幅度为5.0%～30.1%；但在MAT1.5条件下，施肥却显著降低了SOM1.7、SOM6和SOM11中纤维素酶活性，显著提高了SOM5中纤维素酶活性(P<0.05)，对SOM3中纤维素酶活性无显著影响。

注：不同字母代表处理间在0.05水平上差异达到显著。下同。Note: Different letters indicate significant differences between treatments at 0.05 level.The same is as below.图1 两种气侯条件下5个有机质含量农田黑土中土壤纤维素酶活性变化Fig.1 Cellulase activities in Mollisols with five organic matter contents under two climates

2.2 气候-有机质-施肥对农田黑土β-葡糖苷酶活性的影响

MAT4.5条件下，β-葡糖苷酶活性为82.1～277 mg·kg-1·h-1；MAT1.5条件下，β-葡糖苷酶活性为47.1～259 mg·kg-1·h-1(图2)。MAT4.5条件下β-葡糖苷酶的活性总体要高于MAT1.5条件下，增高幅度为3.3%～74.0%，但气候对β-葡糖苷酶活性的影响在不同施肥处理中不同，在不施肥处理中，β-葡糖苷酶活性在MAT4.5条件下一直较高，并且差异随有机质含量变化不大；但是，在施肥处理中，随着有机质含量的升高，MAT1.5与MAT4.5条件下β-葡糖苷酶活性差异逐渐减小，并逐渐趋于一致。两种气候条件下施肥与不施肥处理中，随着土壤有机质含量的升高，β-葡糖苷酶的活性均呈升高的趋势。在不同气候条件下，施肥对土壤中β-葡糖苷酶活性影响不同，MAT1.5条件下施肥能够提升土壤中β-葡糖苷酶的活性，但在MAT4.5条件下施肥对β-葡糖苷酶活性的影响不显著。

2.3 酶活性差异来源分析

为了进一步分析气候-有机质-施肥及其之间的交互作用对纤维素酶和β-葡糖苷酶活性的影响，以气候、有机质含量和施肥作为变量进行了方差分析，以检验3个因素的主效应及交互作用是否造成纤维素酶整体活性和β-葡糖苷酶活性的差异，结果如表2所示。气候、有机质含量和施肥的主效应是造成纤维素酶整体活性与β-葡糖苷酶活性的主要因素。但是，三者之间两两交互作用以及三者间的交互作用对纤维素酶活性影响均达到显著水平，而对β-葡糖苷酶活性均无显著影响。

3 讨论

本研究中，纤维素酶活性随土壤有机质含量无明显变化规律，这可能是由以下原因造成的：(1)黑土有机质含量高，土壤微生物可利用碳源增加[24]，微生物会优先利用土壤中易分解的碳源，导致对纤维素的利用下降，酶分泌量减少，进而导致酶活性降低；(2)纤维素酶是诱导酶[25]，本研究中进入土壤的纤维素底物主要是作物根系，不同有机质含量农田黑土中作物根系量可能是造成这种变化趋势的原因之一。MAT4.5条件下，施肥能较大幅度的提升纤维素酶活性，可能是由以下原因造成的：(1)纤维素是一类C/N很高的有机化合物，不易被微生物分解，施肥后C/N相对降低，可促进微生物对其的分解与利用；(2)施肥会促进土壤中微生物的生长[26-27]，碳源竞争作用增强，部分微生物可将纤维素作为一种碳源，进而分泌更多的纤维素酶，使得土壤中纤维素酶活性增强；(3)施肥促进作物根系生长，进入土壤中的纤维素类底物增多，进而诱导更多的纤维素酶产生，使其活性增强。MAT1.5条件下的纤维素酶活性低于MAT4.5条件下的，这主要是由酶的热力学性质所决定的，即在一定范围内土壤酶活性随温度升高而增强[4,28]；但MAT1.5条件下施肥对纤维素酶的促进作用不显著，这可能是由于温度在很大程度上限制了纤维素酶的活性，也有可能是纤维素分解酶系中某种酶的活性受到了温度的限制。

图2 两种气候条件下5个有机质含量农田黑土中土壤β-葡糖苷酶活性变化Fig.2 β-glucosidase activities in Mollisols with five organic matter contents under two climates

纤维素酶 Cellulaseβ-葡糖苷酶 β-glucosidaseFSig.FSig.气候 Climate435.598<0.00116.0700.001施肥 Fertilization93.265<0.0018.2550.009土壤有机质 Soil organic matter51.475<0.001100.129<0.001气候×施肥 Climate×Fertilization71.115<0.0014.2810.051气候×土壤有机质 Climate×Soil organic matter62.904<0.0011.8300.161施肥×土壤有机质 Fertilization×Soil organic matter54.550<0.0011.5060.237气候×施肥×土壤有机质 Climate×Fertilization×Soil organic matter48.090<0.0012.4690.076

β-葡糖苷酶是纤维素水解过程中催化纤维二糖转化为葡萄糖的酶，直接催化纤维素分解的最后一步过程，其活性直接限制纤维素的水解[2]。β-葡糖苷酶可由多种真菌产生，包括土壤中的子囊菌门和担子菌门[29]。本研究中，随土壤有机质含量的增加，β-葡糖苷酶的活性也随之增加，这说明在本研究选取的5种农田黑土中，纤维素分解酶系中的其他酶可能是限制纤维素酶活性的主要因素，而不是最后一步反应中的β-葡糖苷酶。MAT4.5条件下β-葡糖苷酶的活性要高于气候较冷条件下的，这与Looby和Treseder[11]的研究结果一致，这可能是由酶本身的热力学性质所决定的。但是，施肥会使两种气候条件下不同有机质含量农田黑土中β-葡糖苷酶的活性大小趋于一致，说明施肥能够削弱温度对β-葡糖苷酶活性的影响。

综上所述，气候、土壤有机质含量和施肥均会对土壤纤维素酶和β-葡糖苷酶活性产生影响。但是，作为纤维素分解过程中的限制酶，β-葡糖苷酶活性与纤维素酶整体活性变化规律并不一致。这种现象可能是由于测定过程中底物浓度差异所造成的，在一定范围内，酶的催化速率与底物浓度呈正相关关系[28]。纤维素酶是一个酶系而不是一种单一酶，主要由β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶和β-葡糖苷酶组成，并且β-葡糖苷酶能催化的底物只有β-葡聚糖酶和内切β-葡聚糖酶催化分解的产物[25]。在纤维素酶活性测定过程中，可能β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶活性较低，导致β-葡糖苷酶底物不足，最终呈现出纤维素酶整体活性较低；但在β-葡糖苷酶活性测定过程中，直接供给充足的分解底物，β-葡糖苷酶活性不受底物浓度所限制，能够较真实的展现其活性。为了更好地认识气候-有机质-施肥对土壤纤维素酶活性的影响，将来还需要进一步分析土壤微生物群落组成，明确土壤纤维素酶的来源，揭示土壤中纤维素分解的微生物学机制。