原发性痛风甲基化谱的研究

陈勇 李晓可 应颖 黄海燕 邹荣鑫 褚赞波

痛风是单钠尿酸盐（monosodium urate，MSU）沉积在关节腔、肾脏、软组织、软骨等处所致的晶体相关性疾病，与嘌呤代谢紊乱或尿酸排泄减少所致的高尿酸血症相关，临床上主要表现为特征性急性关节炎。痛风可分为原发性痛风和继发性痛风，原发性痛风目前病因尚未十分明确，通常认为是由遗传因素和环境因素共同致病，原发性痛风具有一定的家族遗传性，可能与多基因遗传有关[1-2]。DNA甲基化是指由S-腺苷甲硫氨酸（SAM）提供甲基基团，在DNA甲基转移酶（DNA methyltransferases，DNMTs）的作用下，将胞嘧啶-磷酸-鸟苷酸（CpG）二核苷酸的胞嘧啶甲基化为5-甲基化胞嘧啶（5-mC）的一种化学反应[3]。研究表明，DNA甲基化在基因表达调控中的作用与肿瘤、衰老等相关。本研究通过对组间差异甲基化位点的分析，了解基因甲基化参与的生物学过程及调控的信号通路，探究与痛风之间的关系。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2016年8月至2017年2月就诊于中国科学院大学宁波华美医院门诊的3例原发性痛风患者作为痛风组，平均年龄33（33,44）岁，均为汉族男性、痛风初次发作，符合2015年ACR/EULAR制定的痛风诊断标准[4]，无长期降尿酸药物使用史。选取同期体检中心健康体检者3例作为对照组，平均年龄43（39,44）岁，均为汉族男性，无痛风或高尿酸血症家族史。两组均排除其他风湿性疾病、癌症、精神病、肾病病史，且均无血缘关系。本研究已通过中国科学院大学宁波华美医院伦理委员会批准，所有研究对象均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 抽取两组研究对象空腹外周静脉血2ml于EDTA管中，使用QIAamp DNA试剂盒（德国QIAGEN公司）提取全基因组DNA。吸取20μl蛋白酶K加入1.5ml干燥灭菌离心管底部，加入200μl血液，再加入200μl Buffer AL后混匀，56℃水浴锅中孵育10min。转移至离心柱并加入200μl的无水乙醇（96%～100%）混匀，6 000g 离心 1min；加入 500μl Buffer AW1，6 000g离心 1min；加入 500μl Buffer AW2，20 000g 离心 3min；离心柱置于另一2ml收集管上6 000g离心1min。最后将离心柱放置于1.5ml收集管中，加入100μl Buffer AE，室温静置 1min，6 000g离心 1min。封闭 1.5ml收集管，标记标本号。

1.2.2 DNA测定 采用核酸蛋白测定仪检测DNA浓度及纯度，清洁测量臂并抽取3μl Buffer AE校准，抽取3μl DNA样本置于下层测量底座上进行测量。DNA样本吸光度 260/280，比值在 1.7～2.0，浓度 50～100ng/μl，总量＞1μg。

1.2.3 DNA 修饰 采用 Zymo EZ DNA Methylation Kit试剂盒（美国Zymo公司）对DNA进行亚硫酸盐修饰。根据试剂盒说明准备试剂，抽取20μl DNA标本（浓度稀释至 10～25ng/μl）及 130μl CT Conversion Reagent置于PCR管中混匀，并将 PCR管置于PCR仪中，在95℃30s、50℃1h条件中进行16个循环。在离心柱中加入600μl M-Binding Buffer及PCR样本后离心；加入100μl M-Wash Buffer后＞10 000g离心30s；再加入200μl M-Desulphonation Buffer室温放置15min后＞10 000g离心30s；加入200μl M-Wash Buffer后＞10 000g离心30s，操作2次；最后将离心柱置于1.5ml收集管上，加入 12μl M-Elution Buffer，转速＞10 000g 离心 30s。

1.2.4 DNA扩增、断裂、杂交 以下部分交由北京怡美通德科技发展有限公司完成并分析。使用PCR技术扩增后将DNA片段化，片段化的DNA沉淀回溶，与Methylation 850k基因芯片（美国Infinium公司）进行杂交。使用芯片扫描软件iscan对芯片灰度扫描，扫描结果使用GenomestudioV2011（美国Illumina公司）进行分析。

1.2.5 原始数据的质控 对每个样品提供12 332个probe作为质控项目，包括 Staining、Extension、Target Removal、Hybridization、Stringency、Non-sepecific Binding、Non-ploymorphic等，结果符合正常实验的结果，芯片状态正常。

1.3 数据处理 对芯片灰度进行扫描，可以得到芯片上每个甲基化点非甲基化探针和甲基化探针强度的原始信号值，经过美国Illumina公司提供的方法进一步标准化，得到甲基化点的水平值（Avg_Beta），Detection Pval等。

1.4 统计学处理 采用R2.15.0统计软件。对差异CpG点进行聚类分析；对差异甲基化点所在的基因作Gene Ontology分析，并采用京都基因和基因百科全书（KEGG）数据库进行Pathway分析。Gene Ontology分析中进行 FDR 校正（FDR＜0.05）。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 差异甲基化位点分析 痛风组与对照组相比，共有20 426个CpG位点甲基化水平发生改变，涉及10 063个基因，如 PTPRN2、MAD1L1、INPP5A、DIP2C、GNAS等。其中有5 719个高甲基化位点，14 707个低甲基化位点，低甲基化位点约占差异性位点的72%。其中参与嘌呤代谢的包括 POLE4、NME1-NME2、NME2、ITPA、PDE、ENTP6、APRT、ALLC 等。在差异性甲基化位点中随机选取5 000个，对其水平值进行聚类分析（图1，见插页），发现痛风组较对照组存在更多的低甲基化位点，而对照组存在较多高甲基化位点。

2.2 Gene Ontology分析 随机选取差异性甲基化CpG位点涉及的1 000个基因进行Gene Ontology分析，包括生物学过程（biological process，BP）（表 1）、细胞组成以及分子功能，结果按P值排序排列（P＜0.05，FDR＜0.05）。参与的生物学过程主要为调控小GTPase介导的信号转导、神经系统发育、神经形成、亲同抗原的细胞黏附以及神经元的分化等；细胞组成有13个，如细胞投射、细胞组成、突触形成、细胞连接以及神经元投射等；分子功能有18个，如蛋白结合、GTPase活性调控、核苷三磷酸活性调控、酶活性调控以及离子结合等。

2.3 Pathway分析 痛风组与对照组差异性甲基化CpG位点涉及的1 000个基因在KEGG映射中，有35个通路差异有统计学意义（P＜0.05）（表2），如磷酸酰肌醇信号系统、脂肪信号因子细胞通路、趋化因子细胞通路、Notch信号通路及FcγR介导的吞噬作用等。

表1 痛风组与对照组差异甲基化基因Gene Ontology分析

3 讨论

DNA甲基化在不改变核苷酸序列的情况下使基因表达水平发生改变，从而产生可遗传的表型，与人类疾病有着密切关系[5]。脊椎动物中，约半数基因在启动子区上有着富含CG的序列，称为CpG岛。多种因素均可以影响含CpG岛启动子区的活性。CpG岛上胞嘧啶C甲基化后，可以通过与转录因子结合或改变染色质结构等，进而起到抑制基因转录的作用[6]。甲基化芯片可以进行高通量的分析，对少量基因组DNA进行快速检测，从而进行分析基因的甲基化状态。本研究通过甲基化芯片技术，对痛风患者及健康体检者进行全基因组的分析，筛选出差异性甲基化位点，根据甲基化位点对相关基因参与的生物学过程、分子功能、细胞组成及信号通路进行分析，从而探究基因甲基化与痛风发病机制之间的关系。

表2 痛风组与对照组差异甲基化基因Pathway分析

基因异常甲基化与痛风的发展具有相关性，已有研究发现在痛风患者中，基因UMOD的甲基化水平明显高于正常人[7]，而NRBP1的启动子区呈低甲基化[8]，CCL2启动子区的甲基化水平亦偏低[9]。通过聚类分析，笔者发现痛风组与对照组相比基因甲基化水平存在明显差异，其中CpG低甲基化位点约占差异性位点的72%。同时发现与对照组相比，痛风组基因组中参与嘌呤代谢的基因，如POLE4、NME1-NME2、NME2等基因呈高甲基化，而ITPA、PDE、ENTP6、APRT等呈低甲基化状态。其中，痛风组基因组中参与嘌呤代谢的PDE1C亦呈低甲基化状态（P＜0.01），笔者认为这些基因的低甲基化可能增加基因表达，从而使嘌呤代谢产物一部分转化为尿酸，引起体内尿酸水平的升高。

尿酸沉积引起的痛风性关节炎与趋化因子引起的炎性级联反应相关，尿酸盐晶体可以激活NLRP3炎性体，引起IL-1β分泌，从而刺激中性粒细胞细胞的活化，使其释放大量的促炎因子及趋化因子，在巨噬细胞、中性粒细胞、肥大细胞及细胞因子等的作用下，引发炎症级联反应[10]。Gene Ontology分析和Pathway分析显示，痛风组与对照组相比，发生差异性甲基化基因参与的通路有趋化因子细胞通路、FcγR介导的吞噬作用、T细胞受体信号通路、B细胞受体信号通路等炎性通路。笔者认为上述通路基因的差异性甲基化可以引起炎症因子水平升高，可能与痛风性的急性发作有关。

尿酸是人体内天然的抗氧化剂、自由基清除剂，对神经系统可能具有一定的保护作用，研究发现，尿酸水平可能与帕金森病、阿尔茨海默病以及肌萎缩侧索硬化等神经系统疾病的发病相关[11-13]。在Gene Ontology和Pathway分析中，痛风组及对照组之间差异性甲基化基因分布参与了神经系统的形成、发育以及突触形成、神经元投射等，还参与了胶质瘤通路。根据本次研究结果，笔者认为痛风的发病与神经系统疾病在基因水平上可能有联系，但在此方面研究较少，需进一步研究探讨。

此次研究样本量较少，需要选取相关基因扩大样本量进行验证，从而为探讨DNA甲基化在痛风发生、发展中的作用提供理论依据。同时此次研究仅对痛风患者和健康体检者基因的差异性甲基化进行了分析，没有进行机体内基因表达水平的测定，下一步可以对这些基因所表达的mRNA和蛋白质进一步分析。