宫颈癌组织中HPV16、18E6与p53的表达水平及临床意义

陈 宓

宫颈癌是1种高发于发展中国家女性生殖系统的恶性肿瘤，每年的发病率及死亡率居高不下[1]。宫颈癌发病机制复杂，癌基因、早婚早育、性生活混乱、不良生活习惯及病毒感染等多种因素共同参与其中[2-3]。但根据数据调查显示，绝大多数宫颈癌患者均有高危型人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染史，HPV已被证实是宫颈癌癌前病变及发病的独立影响因素[4]。作为HPV中最常见的类型，HPV16和HPV18型病毒主要通过抑制抑癌基因的功能，促使细胞癌变[5]。本研究对宫颈癌组织中的人乳头瘤病毒16、18型E6蛋白(human papillomavirus type16、18 E6，HPV16、18E6)与p53的表达水平进行检测，并分析其临床意义，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选取我院2012年4月至2017年7月收治的宫颈癌患者131例，年龄29～61岁，分别收集其手术切除的宫颈癌组织及癌旁正常组织作为研究组和对照组。根据TNM临床分期标准对131例患者进行分期，其中Ⅰ期78例，Ⅱ期43例，Ⅲ期10例。纳入标准：①术后经组织病理学检测确诊为宫颈癌；②术前未接受放疗、化疗、靶向治疗及其他肿瘤系统性治疗；③有HPV16和HPV18型病毒感染史。排除标准：①合并其他系统恶性肿瘤；②住院资料不完整；③依从性不好，不能配合研究。本研究上报本院医学伦理委员会批准，所有患者对本研究中样本收集充分知情并理解，均自愿签署知情同意。

1.2 主要试剂与仪器

中性甲醛(上海钰博生物科技有限公司)；PBS缓冲液(武汉博士德生物工程有限公司)；EDTA抗原修复液(青岛捷世康生物科技有限公司)；兔抗人HPV16、18E6单克隆抗体、鼠抗人p53多克隆抗体(上海笃玛生物科技有限公司)；羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG(上海研谨生物科技有限公司)；辣根酶标记链霉卵白素(上海赫澎生物科技有限公司)；DAB显色盒(南京赛泓瑞生物科技有限公司)；苏木素(上海宝曼生物科技有限公司)；生物组织包埋机(型号：SDSCV9000，意大利Diapath公司)；组织切片机(型号：OST 5000，美国Warner公司)；电热恒温水箱(苏州凯特尔仪器设备有限公司)。

1.3 方法

采用免疫组织化学染色法检测宫颈癌及癌旁正常组织中HPV16、18E6与p53蛋白的表达水平。所有组织在离体1 h内用中性甲醛固定，依次经脱水、透明、石蜡包埋后用组织切片机切成连续切片，厚度约为4 μm，接着对组织切片进行脱蜡、漂片烘干、抗原修复、过氧化物酶阻断，山羊血清封闭后，滴加一抗兔抗人HPV16、18E6单克隆抗体和鼠抗人p53多克隆抗体，2种抗体工作浓度均为1∶100，4 ℃孵育过夜，经PBS缓冲液3次清洗，滴加二抗羊抗兔IgG和羊抗鼠IgG，37 ℃孵育15 min，用PBS缓冲液清洗3次，加入适量经PBS缓冲液稀释的辣根酶标记链霉卵白素，37 ℃孵育10 min，PBS缓冲液清洗后，严格按照DAB显色盒说明书对切片进行显色操作，清洗后用苏木精复染，再清洗、脱水、制片，采用光学显微镜进行阅片。

免疫组化结果判断：2名具有执业资格经验丰富的病理科医生在双盲情况下进行阅片，避开组织坏死出血及刀口区，随机选取5个高倍视野，每个视野包含100个细胞，观察染色程度，统计每个视野阳性细胞率并求平均值。将不着色、黄色、棕黄色、黄褐色分别记为0、1、2、3分；将阳性细胞率≤10%、>10%～20%、>20%～50%、>50%～80%、>80%分别记为0、1、2、3、4分。将两项评分相乘计算免疫组化评分(immunohistochemical scores，IHS)，当IHS≤2分时，记为(-)，当IHS≥3分时，记为(+)。

1.4 观察指标

宫颈癌组织及癌旁正常组织中HPV16、18E6与p53的表达水平，宫颈癌组织中p53的表达水平与HPV16、18E6的关系，以及宫颈癌患者年龄、TNM分期、组织学分级、淋巴结转移情况及病理类型等病理临床特征与HPV16、18E6和p53的表达水平间的关系。

1.5 统计学处理

本研究所有数据采用SPSS20.0数据统计软件进行分析，采用卡方检验对计数资料进行分析，p53表达水平与HPV16、18E6的关系采用Spearman等级相关进行分析。P<0.05时，差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 宫颈癌组织及癌旁正常组织中HPV16、18E6和p53的表达情况

HPV16、18E6主要表达于细胞核，少部分表达于细胞质，p53表达于细胞核，免疫组化阳性染色均为棕黄色。HPV16、18E6在宫颈癌组织及癌旁正常组织中的阳性表达率分别为74.8%(98/131)和39.7%(52/131)，p53在宫颈癌组织及癌旁正常组织中的阳性表达率分别为22.1%(29/131)和1.5%(2/131)，差异均具有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 宫颈癌组织及癌旁正常组织中HPV16、18E6和p53的表达情况比较(例，%)

2.2 宫颈癌组织中p53的表达水平与HPV16、18E6的关系

比较HPV16、18E6表达水平不同的宫颈癌组织中p53的表达，HPV16、18E6阳性的宫颈癌组织中p53的阴性表达率为76.5%(75/98)，宫颈癌组织中p53的表达水平与HPV16、18E6呈负相关(γ=-0.58，P<0.05)。见表2。

表2 宫颈癌组织中p53与HPV16、18E6的关系/例

2.3 HPV16、18E6及p53与宫颈癌临床病理特征的关系

分析131例宫颈癌组织中HPV16、18E6的表达水平发现，HPV16、18E6与患者年龄、组织学分级和病理分型有关(P<0.05)，与TNM分期和淋巴结转移情况无关(P>0.05)；p53表达与患者TNM分期和组织学分级有关(P<0.05)，与年龄、淋巴结转移和病理分型情况无关(P>0.05)。见表3。

表3 HPV16、18E6及p53与各病理临床特征的关系/例

3 讨论

宫颈癌的发生是多个致病因素共同作用的结果，作为最有公认度的宫颈癌高危因素，高危型HPV的持续感染可加速宫颈癌前病变到癌变的过程[6]。流行病学调查结果显示，仅有1%～10%的宫颈癌患者无HPV感染史[7]。HPV有多种类型，在宫颈癌患者中最为常见的有HPV16型及HPV18型，分别促进宫颈鳞癌及宫颈腺癌的发生[8-9]。作为一种恶性肿瘤，宫颈癌各临床病理特征与治疗方案的选择及疾病预后都密切相关，因此寻找与各临床病理特征有关的指标，对宫颈癌患者意义重大。

HPV16、18主要通过早期癌蛋白E6发挥其致癌作用，其作用机制为HPV16、18E6与p53结合，使p53功能化结构发生改变，丧失生理作用，并促使其进入泛素依赖的降解过程[10-11]。生理情况下，细胞内p53蛋白表达处于低水平，而当机体受到不良刺激，DNA发生损伤时，p53蛋白水平明显上升，起到修复损伤DNA、诱导DNA发生损伤且不能修复的细胞凋亡以及调节细胞增殖周期的作用，这对维持机体细胞正常增殖及保持基因组的稳定性具有重大意义[11]。此外，p53还能与某些序列的DNA发生特异性结合，参与其他细胞周期调控基因的激活过程，抑制原癌基因表达，进而抑制肿瘤的生长与转移[12]。当HPV16、18E6促使p53丧失正常功能并发生降解，致使DNA受损的细胞异常增殖，最终导致癌变[13]。本研究结果显示，宫颈癌组织中HPV16、18E6及p53的阳性表达率均高于正常宫颈组织，提示宫颈癌患者组织中HPV16、18E6及p53的表达水平呈上升趋势。HPV16、18E6还能将自身病毒基因与宿主细胞的基因进行整合，通过细胞增殖而不断繁殖，使机体内HPV16、18E6持续维持在较高水平[14]。HPV16、18E6蛋白具有特殊的锌指结构域，这种特殊的结构域使HPV16、18E6具有与DNA、RNA结合，抑制其他细胞增殖调节蛋白作用，进而破坏细胞正常增殖周期的功能[15]。此外，HPV16、18E6还能通过抑制端粒酶抑制因子X1的表达，上调感染细胞中端粒酶活性，致使宫颈细胞失去增殖限制发生永生化增殖，引起癌变[16]。

本研究结果还显示，宫颈癌组织中p53的表达水平与HPV16、18E6呈负相关，且HPV16、18E6在宫颈癌组织中的表达水平与患者年龄、组织学分级和病理分型有关，与TNM分期和淋巴结转移情况无关；p53的表达水平与患者TNM分期和组织学分级有关，与年龄、淋巴结转移和病理分型情况无关。

综上所述，HPV16、18E6与p53蛋白在宫颈癌组织中的表达水平均呈上升趋势，宫颈癌组织中p53的表达水平与HPV16、18E6呈负相关，HPV16、18E6通过诱导p53降解，促进宫颈癌的发生发展。此外，HPV16、18E6的表达水平与患者年龄、组织学分级和病理分型呈相关性，p53的表达水平与患者TNM分期和组织学分级呈相关性。