血清环状RNA PTENP1、HIPK3联合β-HCG在绒毛膜癌诊断和预后评估中的价值

张宇华 王晓彬 刘 佳 穆 鹏

绒毛膜癌是1种高度恶性的肿瘤，多继发于葡萄胎、流产或足月分娩以后。早期绒毛膜癌症状不典型甚至无症状，随着瘤体增大而表现不规则阴道流血、子宫变大而软等症状，此时多已进展到中晚期[1]。目前，绒毛膜癌的筛查手段主要包括血清学指标人绒毛膜促性腺激素β亚基(β-Human chorionic gonadotropin，β-HCG)和超声。然后，血清β-HCG缺乏特异性，其在多种生理、病理状态下均会增高[2-3]；报道也指出B超对绒毛膜癌的诊断率仅为67.4%左右[4]。

环状RNA(circular RNA，circRNA)是一类重要的非编码RNA，其与癌症的发生、发展及转移密切相关，是近年研究的热点[5]。研究发现多种非编码RNA在绒毛膜癌患者体内存在异常表达，且与癌细胞增殖、侵袭与转移等密切相关[6-7]，但关于circRNA在绒毛膜癌中的临床价值却尚未见报道。本研究旨在探讨绒毛膜癌患者血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3联合β-HCG的诊断及预后价值，以期为绒毛膜癌的诊疗提供新的途径。

1 材料与方法

1.1 研究对象的纳入

收集本院2014年2月到2015年5月确诊的绒毛膜癌患者140例，患者均为首次住院且经内镜组织学检查确诊。绒毛膜癌的诊断和分期依据西班牙医学肿瘤学会(SEOM)发布的2017版妊娠滋养细胞疾病临床管理指南[8]。其中Ⅰ～Ⅱ期患者77例，Ⅲ～Ⅳ期患者63例；发生远处转移54例(阴道转移39例、肺转移7例、脑转移4例、肝脾转移4例)，未发生远处转移86例。同期选取我院体检的健康女性140例。纳入标准：①语言表达能力正常，能与调查人员进行正常的沟通；②研究对象自愿参与本研究。排除标准：①既往有其他肿瘤疾病史者；②排除脑卒中、老年痴呆等神经系统疾病导致的无法采集相关信息和精神分裂症的患者；③孕妇或哺乳期女性。本研究的开展经医院伦理委员会批准，所有纳入对象均签署了项目知情同意书。

1.2 临床资料与样本的采集

由专业的研究人员记录所有研究对象年龄、体重指数(body mass index，BMI)、吸烟史、饮酒史等基本信息。两组间在年龄、BMI、吸烟史及饮酒史的差异均无统计学意义(P>0.05)，表明两组间具有可比性，见表1。

使用促凝采血管收集经禁食10 h以上绒毛膜癌患者接受治疗前及健康对照者入院体检时的静脉血5 ml。收集的标本在1 h内于4 ℃条件下以3 500 g离心力(离心半径为10 cm)离心10 min，收集上层血清，并放入-80 ℃冰箱保存备检测。

表1 两组间临床资料比较

1.3 血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG水平的检测

按照血清RNA提取试剂盒说明书步骤进行血清总RNA提取。取上述提取的RNA，使用去除基因组逆转录试剂盒逆转录为cDNA，进行实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，RT-PCR)。RT-PCR按照SYBR GREEN说明书进行，反应体系为：Mix 10 μl，上下游引物各0.8 μl，cDNA 2 μl，DEPC水6.4 μl。荧光定量PCR循环条件：95 ℃变性5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，45个循环，每组设置3个复孔。应用PrimerPremier5.0进行PCR引物设计，使用的circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3与GAPDH引物序列见表2，引物合成由北京赛百盛基因技术有限公司提供。采用2-ΔΔCt法计算circRNAs的相对表达量，△Ct值=样本Ct值-GAPDH Ct值。血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和GAPDH基因熔解曲线峰型单一，说明引物没有形成引物二聚体，也没有非特异性扩增。

血清β-HCG的检测采用化学发光法，试剂由上海百蕊生物科技有限公司提供。质控品采用英国朗道公司肿瘤高、低值质控品，质控判断标准为Westgard多规则分析。

同时计算血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG检测的批内、批间变异系数值，以评估实验的重复性和精确度。

表2 circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3与GAPDH的引物序列

1.4 随访

依据患者纳入研究的时间，对患者进行40个月电话随访，并记录患者的生存时间。随访终点为：①40个月内患者死亡；②40个月内患者退出该项研究；③40个月随访结束。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 两组血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG水平比较

本次实验血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG的批内变异系数分别为2.7%、2.6%、2.5%，批间变异系数分别为3.0%、2.8%、2.9%，均小于5%，提示样本检测具有良好的重复性和精确度。绒毛膜癌患者血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG水平显著高于健康对照组(P<0.05)，见表3。

表3 两组间血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG水平比较

2.2 血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG与绒毛膜癌临床特征的关系

如表4所示，血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG水平与绒毛膜癌患者年龄、吸烟史、饮酒史和BMI等因素均无明显关系(P>0.05)。此外，血清circRNA-PTENP1和circRNA-HIPK3水平与绒毛膜癌TNM分期(PTENP1：γ=0.514，P=0.004；HIPK3：γ=0.465，P=0.009)及远处转移(PTENP1：γ=0.501，P=0.005；HIPK3：γ=0.449，P=0.013)呈线性关联。

表4 血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG与绒毛膜癌临床特征的关系

2.3 血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG对绒毛膜癌的鉴别价值

ROC曲线分析显示，血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG在区分绒毛膜癌与健康对照的AUC分别为0.841(95%CI：0.754～0.927，P<0.001)、0.815(95%CI：0.672～0.908，P<0.001)和0.612(95%CI：0.558～0.706，P=0.002)；在各指标约登指数为最大值时对应的灵敏度/特异度分别为：73.7%/90.7%、78.5%/86.9%和70.2%/59.3%；诊断界值分别为78.6(-log)、29.0(-log)和7.5 mIU/ml。联合血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG在区分绒毛膜癌与健康对照的AUC为0.923(95%CI：0.893～0.974，P<0.001)，灵敏度92.3%，特异度83.4%，见图1。

图1 血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG对绒毛膜癌鉴别价值

2.4 血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG对绒毛膜癌的风险评估

二元logistic回归分析结果，见表5。单因素分析显示，血清高circRNA-PTENP1和高circRNA-HIPK3水平是绒毛膜癌发病的危险因素(P<0.05)；多因素分析显示，在校正年龄、BMI、吸烟、饮酒等因素后，血清高circRNA-PTENP1和高circRNA-HIPK3水平仍是绒毛膜癌发病的独立危险因素(P<0.05)。

2.5 血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG水平与绒毛膜癌预后的关系

经40个月随访，共48例绒毛膜癌患者死亡，0例失访。140例绒毛膜癌患者分别依据PTENP1、HIPK3和β-HCG水平的中位数分为高PTENP1与低PTENP1组、高HIPK3与低HIPK3组和高β-HCG与低β-HCG组。相比低PTENP1组，高PTENP1组生存率显著降低(χ2=5.694，P=0.006，图2A)；相比低HIPK3组，高HIPK3组生存率显著降低(χ2=17.859，P<0.001，图2B)；而低β-HCG组和高β-HCG组间生存率差异无统计学意义(χ2=1.173，P=0.216，图2C)。

3 讨论

绒毛膜癌的恶性程度高，侵袭能力强，是威胁女性人群健康的主要疾病之一。生物标志物是血液、尿液或者组织中能检测疾病状态的分子指标，可用于疾病的检测[9]。它们在体液中的浓度变化可以提供疾病的进展情况，理想情况下，生物标志物应具有检测早期小块肿瘤的高敏感性、高特异性，并且在非肿瘤中不会增加。目前，绒毛膜癌诊断仍缺乏有效指标。β-HCG是绒毛膜癌辅助诊断的重要指标，但多种病理、生理状态下β-HCG均可出现升高[10-11]：正常怀孕、双胞胎，葡萄胎、或在内分泌疾病中如脑垂体疾病、甲状腺功能亢进、妇科疾病如卵巢囊肿、子宫癌等；此外，其他系统实体瘤畸胎瘤、胰腺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、肺癌等β-HCG亦可升高。值得注意的是，本次研究我们也发现β-HCG用于鉴别绒毛膜癌与健康女性对照的特异度不高，仅为59.3%，这与早前报道β-HCG缺乏特异性相一致[10-11]。

circRNA是1类新型的基因调控因子，能与DNA、RNA或蛋白质结合，在转录或转录后水平，以顺势调控或反式调控的方式，调节基因的表达，参与几乎人类所有的生理及病理性生物学过程，已被证实在多种肿瘤如肝癌、胃癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤、前列腺癌等中存在异常表达。血清circRNA-PTENP1和circRNA-HIPK3是近年研究发现的在女性乳腺癌及多个生殖系统肿瘤发生发展中起重要作用的促癌基因。研究先后指出，circRNA-PTENP1和circRNA-HIPK3的差异表达可直接对靶基因如miR-17、P53等转录后的调控而促进癌细胞的增殖、迁移，并抑制细胞凋亡[12-15]。Zheng等[12]通过收集并提取膀胱癌与健康者血清外泌体PTENP1发现，膀胱癌患者PTENP1水平显著高于健康对照，且高水平PTENP1与膀胱癌患者不良预后相关。Yu等[13]的机制研究同样证实，经脂质体转染PTENP1 mimics于膀胱癌T24细胞以上调T24细胞中PTENP1的表达水平，观察到上调PTENP1后可显著下调下游靶基因miR-17的表达，进而促进T24细胞的增殖与迁移能力，并抑制癌细胞凋亡，提示PTENP1对膀胱癌癌细胞的生物学活性具有促进作用。近期，Chen等[14]的研究发现，PTENP1可通过AKT-MAPK通路促进乳腺癌上皮间质转化及乳腺癌细胞的增殖和迁移。HIPK3作为促癌基因，有关价值研究也很深入。Li等[15]利用二代测序技术与生物信息学分析，在膀胱癌患者中筛选出了HIPK3，机制研究发现HIPK3在膀胱癌组织和细胞系中显著上调，并分别与膀胱癌分级、浸润和淋巴结转移呈正相关，且过量表达HIPK3能有效促进膀胱癌细胞在体外的迁移、侵袭和血管生成，促进膀胱癌生长和转移。然而，关于circRNA-PTENP1和circRNA-HIPK3在绒毛膜癌中的表达情况未见报道，其是否具有成为早期肿瘤诊断标志物的潜力是本次研究需要探讨的。本研究通过对140例绒毛膜癌患者血清学的分析发现，血清circRNA-PTENP1和circRNA-HIPK3在绒毛膜癌中显著增高，此外，血清circRNA-PTENP1和circRNA-HIPK3水平与绒毛膜癌患者分期和远处转移呈正相关，两者在Ⅲ～Ⅳ期及发生远处转移患者中的水平增高最为显著，提示两者与绒毛膜癌的进展相关，该部分结果与前期研究基本相符[13-15]。

表5 血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG对绒毛膜癌的风险评估

注：a为校正年龄、BMI、吸烟、饮酒等因素。

图2 血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG水平与绒毛膜癌预后的关系

进一步ROC曲线分析显示，血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG在区分绒毛膜癌与健康对照的灵敏度/特异度分别为73.7%/90.7%、78.5%/86.9%和70.2%/59.3%；而联合三者后在区分绒毛膜癌与健康对照的灵敏度显著提高，达到92.3%，提示联合血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG具有较高的诊断价值。进一步二元logistic回归分析显示，在校正了年龄、BMI、吸烟、饮酒后，血清高circRNA-PTENP1和高circRNA-HIPK3水平仍是绒毛膜癌发病的独立危险因素，证实了血清miR-145、miR-29和miR-217水平差异可作为绒毛膜癌的诊断指标。生存分析结果提示，高PTENP1组和高HIPK3组患者的预后更差，这与前期多个研究结果相符[13-15]。然而，本次研究仍有如下不足：①本次研究纳入的研究对象均来自于本院，这可能会对研究结果造成一定的偏倚影响，今后需要多中心的队列研究来进一步验证我们的结果；②本研究纳入140例绒毛膜癌患者，纳入的例数仍然是有限的，后期需要更大样本量的研究来证实血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG的临床价值。

综上所述，本次研究发现联合circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG对绒毛膜癌的潜在诊断价值，并发现circRNA-PTENP1与circRNA-HIPK3在绒毛膜癌风险评估和预后评价中有重要意义，有望为绒毛膜癌的临床诊治提供新的途径。