白头翁皂苷抗小鼠血吸虫病肝纤维化的试验

陈岩勤 高秀丽 诸葛洪祥 杨世林 李笑然 杨盛刚

摘要 [目的]研究白头翁皂苷经腹腔注射给药对血吸虫病肝纤维化的作用机制。[方法]将30只C57BL/6雌性小鼠随机分为阴性对照组、阳性对照组和白头翁皂苷组，每组10只。血吸虫感染40条尾蚴6周后，阴性对照组、阳性对照组腹腔注射0.9%生理盐水，白头翁皂苷组腹腔注射白头翁皂苷注射液。感染8周后，检测血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）及天门冬氨酸氨基转移酶（AST）含量;称取小鼠体重及肝重;免疫组化观察肝组织α-SMA表达。[结果]白头翁皂苷组小鼠的体重、肝重、ALT及AST含量与阳性对照组比较均有统计学意义，白头翁皂苷组肝脏α-SMA表达明显低于阳性对照组。[结论]白头翁皂苷经腹腔注射给药可明显减轻日本血吸虫病所引起的肝纤维化程度。

关键词 白头翁皂苷;肝纤维化;丙氨酸氨基转移酶;天门冬氨酸氨基转移酶;α-平滑肌肌动蛋白

中图分类号 S567文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2019）14-0181-02

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.14.053

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Abstract [Objective]The research aimed to study the effects of total saponins of pulsatilla against liver fibrosis in mice infected with Schistosoma japonicum. [Method]Thirty C57BL/6 female mice were randomly divided evenly into negative control group， positive control group and Pulsatilla saponin group. After positive control group and Pulsatilla saponin group infected with 40 S.japonicum cercariae for 6 weeks， the negative control group and the positive control group were intraperitoneally injected with 0.9% normal saline， and the Pulsatilla saponin group were intraperitoneally injected with Pulsatilla saponin. After 8 weeks of infection， The serum of all mice were measured the value of ALT and AST;body weight and liver weight of the mice were weighed;αSMA expression was observed by immunohistochemistry. [Result] The body weight， liver weight， ALT and AST content of the pulsatilla saponin group were significantly different from those of the positive control group. The expression of αSMA in the liver of the pulsatilla saponin group was significantly lower than that of the positive control group. [Conclusion] The pulsatilla saponin by intraperitoneal injection can significantly reduce the degree of liver fibrosis caused by Schistosoma japonicum.

Key words Pulsatilla saponin;Hepatic fibrosis;ALT;AST;αSMA

作者简介 陈岩勤（1972—），女，河南南阳人，副教授，博士，从事感染与免疫方向的研究。*通信作者，副教授，博士，从事药物分析研究。

收稿日期 2019-03-04;修回日期 2019-03-21

血吸虫病是一种慢性虫卵肉芽肿的免疫病理反应，沉积于肝微血管内的大量虫卵以及宿主对虫卵的炎症反应和纤维化为血吸虫病的主要病变[1]。目前治疗血吸虫病的有效药物是吡喹酮，但经过杀虫治疗后，肝组织中的沉积虫卵继续释放虫卵可溶性抗原激活一系列导致肝脏病变的信号通路，使肝脏虫卵肉芽肿持续出现并诱导肝纤维化[2]。在肝纤维化过程中肝星状细胞由静止状态转变为活化状态，胶原蛋白分泌增多，α-平滑肌肌动蛋白（alpha-smooth muscle actin，α-SMA）合成增多，肝臟损伤的同时调动多种与免疫相关细胞的应答以及细胞间的浸润，加速肝纤维化的发生[3]。临床上丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）常作为观察肝病患者疾病发展及预后的一个指标，是检测肝功能最敏感的指标之一，在一定程度上作为肝纤维化的诊断、治疗的动态变化的参考[4]。

白头翁为毛茛科植物白头翁的干燥根，作为中药始载于《神农本草经》，其性寒，味苦，具有清热解毒、凉血止痢、燥湿杀虫的功效[5];尚有文献报道其在抗肿瘤[6-9]、抗病毒[10]等方面的药理作用;路西明等[11]研究发现白头翁对异烟肼和利福平引起的血清ALT升高有对抗作用，且能对抗药物引起的肝细胞死亡，具有保肝作用。因此探索白头翁皂苷在干预血吸虫肝纤维化发展进程中的作用，期望从白头翁皂苷对血吸虫病所致的肝纤维化着手来研究其作用机制，为肝纤维化的治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 动物和钉螺

C57BL/6小鼠，雌性，由苏州大学实验动物中心提供，体重18～20 g;阳性钉螺（O.hupensis）购自江苏省血吸虫病防治研究所。

1.2 药品试剂及仪器

白头翁皂苷由苏州大学医学部药学院杨世林教授课题组提供;0.9%生理盐水购自江苏四环生物股份有限公司;ALT、AST试剂盒购自南京建成生物技术公司;20 mg/mL 白头翁皂苷注射液用无菌生理盐水溶解200 mg PRS定容至100 mL经无菌抽滤后分装4 ℃储存备用。α-SMA一抗购自武汉博士德生物工程有限公司;二抗免疫组化试剂盒购自上海基因科技有限公司;XD-811半自动生化分析仪为上海迅達医疗仪器有限公司产品;德国Leica公司产UC6病理切片机。

1.3 方法

用去氯水25 ℃浸泡钉螺白炽灯下照射逸出尾蚴。将30只小鼠随机平均分为阴性对照组、阳性对照组、白头翁皂苷组，采用腹部贴片法感染尾蚴40条;感染6周后，白头翁皂苷组每日按剂量200 mg/kg腹腔注射白头翁皂苷药物，阴性对照组、阳性对照组按0.02 mL/g容量给小鼠腹腔注射生理盐水。8周后，禁食12 h，小鼠眼眶静脉丛采血，离心，取血清测定ALT、AST含量;取肝脏称重，并取左叶组织1 cm3置入10%中性甲醛溶液中，4 ℃冰箱中固定24 h制作石蜡切片用于免疫组化检测α-SMA表达。

1.4 统计学分析 所有试验数据用±S表示，利用SPSS 19.0软件进行统计学分析，组件比较利用t检验评价，P<0.05具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 小鼠体重及肝脏重量的变化

从表1可看出，经过白头翁皂苷治疗后第8周末，阳性对照组与阴性对照组相比，阳性对照组体重显著降低（P<0.05）;白头翁皂苷组比阳性对照组体重升高显著（P<0.05）;阳性对照组肝重与阴性对照组相比显著升高（P<0.05）;白头翁皂苷组与阳性对照组比较肝重下降显著（P<0.05）。

2.2 血清ALT、AST含量的变化

从表2可看出，阳性对照组小鼠血清中ALT、AST含量均显著高于阴性对照组（P<0.05）;白头翁皂苷组小鼠血清中ALT、AST含量均显著低于阳性对照组（P<0.05）。

2.3 小鼠肝脏免疫组化结果

肝脏α-SMA免疫组化显示（图1），阴性对照组少有α-SMA表达;阳性对照组α-SMA表达主要集中在虫卵内部及周围区域，着色明显深于白头翁皂苷组α-SMA的表达。

3 讨论与结论

日本血吸虫感染小鼠引起肝脏纤维化的病理模型与人类血吸虫病肝纤维化极为相似，以此为研究对象研究开发治疗或逆转肝纤维化的药物具有重要的意义。有学者认为肝纤维化可以逆转，肝硬化不可逆转，在血吸虫肝病的早期应用抗纤维化的治疗措施有利于肝纤维化的逆转。该研究建立了血吸虫病肝纤维化小鼠模型，利用白头翁皂苷腹腔给药发现能够显著降低血吸虫病小鼠血清中ALT和AST的含量。而ALT和AST能够敏感体现肝细胞膜损伤的程度，肝细胞膜损伤后会使ALT和AST进入血液，从而使小鼠血清中AIT和AST升高。所以血清中ALT和AST数值的大小可以间接地反映出肝细胞受损的程度。试验结果显示白头翁皂苷能够有效降低ALT和AST水平。肝星状细胞活化是肝纤维化发生、发展的中心环节，α-SMA表达是肝星状细胞激活的标志，其表达量直接与肝纤维化程度相关联。通过对白头翁皂苷对血吸虫病引起的肝纤维化的治疗研究发现其能减弱肝纤维化的进展，为其能够成为治疗肝纤维化药物打下基础。

参考文献

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