河北省番茄病毒病种类鉴定及分布

2019-08-27张爱红杨菲李希望邸垫平苗洪芹潘阳孙祥瑞张尚卿孙茜

安徽农业科学 2019年14期

张爱红杨菲李希望邸垫平苗洪芹潘阳孙祥瑞张尚卿孙茜

摘要 [目的]鉴定河北省番茄上主要病毒病种类，明确病原和分布。[方法]采用分子生物学技术及免疫试纸条技术，对2016—2018年采自河北省8个县市18个番茄主产区的番茄样品进行病毒病种类鉴定。[结果]采集的番茄样品中共检出3种病毒，分别为番茄黄化曲叶病毒（tomato yellow leaf curl virus）、番茄褪绿病毒（tomato chlorosis virus）、番茄花叶病毒（tomato mosaic virus）。其中TYLCV是目前河北省危害最严重、分布最广泛的一种病毒，各调查地区均能检出，检出率为63.29%，其次为ToCV，检出率为17.19%，田间主要表现与番茄黄化曲叶病毒混合侵染;ToMV检出率仅为0.09%，为零星发生。[结论]河北省番茄病毒病的主要种类为粉虱传播的番茄黄化曲叶病毒和番茄褪绿病毒。

关键词番茄;病毒病;鉴定;分布

中图分类号 S436.412.1+1文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2019）14-0139-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.14.041

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract [Objective] To determine the pathogens and distribution of tomato viral diseases in Hebei Province. [Method] In 2016-2018， a total of 346 infected tomato plant samples were collected from 18 main production areas of tomato in Hebei Province. Molecular biology and immunostrip techniques were used to detect the pathogens of tomato samples . [Result] Three kinds of tomato viruses were identified in the samples， they were tomato yellow leaf curl virus （TYLCV），tomato chlorosis virus （ToCV） and tomato mosaic virus （ToMV）. TYLCV could be detected at every sampling site with the highest detection rate of 63.29%. The detection rate of ToCV was 17.19%， and all the positive samples were mixinfected with TYLCV. ToMV occurred sporadically in Hebei Province with a detection rate of only 0.09%. [Conclusion] Three virus were detected， TYLCV and ToCV which transmitted by whiteflies were the main types of tomato viruses in Hebei Province.

Key words Tomato;Virus disease;Identification;Distribution

作者简介张爱红（1981—），女，河北保定人，副研究员，硕士，从事植物病毒研究。*通信作者：

邸垫平，研究员，博士，从事植物病毒研究;苗洪芹，研究员，硕士，从事植物病毒研究。

收稿日期 2019-02-21

番茄是一种种植广泛的蔬菜作物。目前，已发现的番茄病毒种类约40种，其中在我国发生并报道的病毒病有18种，较常见的包括烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus）、黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus）、番茄花叶病毒（Tomato mosaic virus）等 [1-2]。在不同环境、栽培模式的影响下，番茄病毒病的种类有所差别，且各地的优势病毒种类会随环境及种植模式的改变而发生变化。20世纪70年代，我国番茄病毒病以烟草花叶病毒（TMV）为绝对优势种群，黄瓜花叶病毒（CMV）发生相对较轻[1]。20世纪80年代以来，随着大面积推广抗TMV品种，我国部分地区田间番茄病毒种群发生变化[2]。20世纪90年代，随着气候变化及种植模式的改变，烟粉虱传播的病毒病在全球范围内暴发、扩展和蔓延。2008年，粉虱传播的番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl virus）在河北省首次被发现[3]，2014年番茄褪绿病毒（Tomato chlorosis virus）在河北省检出[4]。番茄病毒病病原种类较多，田间发病症状较为复杂，不同的病毒传播方式不同，因而防治的关键点也不同。近年来，河北省番茄种植面积不断扩大，因此，明确不同地区番茄病毒病的病原种类对控制病害的发生和流行具有重要意义。笔者于2016—2018年对河北省番茄主产区保护地番茄病毒病的发生情况进行较为系统的调查，以期为番茄病毒病症状识别、防治提供指导。

1 材料与方法

1.1 番茄病毒病的调查及样品采集

2016年1月至2018年8月，在河北省石家庄高邑、藁城、栾城、保定定州、清苑、定兴、博野、雄安新区、唐山滦南、丰南、乐亭、沧州献县、肃宁、衡水饶阳、邯郸永年、肥乡、邢台临城、邢台市区18个县区调查番茄病毒病发生情况，采集表现黄化、褪绿、卷曲、花叶、矮化等症状的叶片，分别装在采集袋中，标明采集时间、地点、品种、症状，保存于-70 ℃冰箱中待測。以温室培养的网箱内健康的番茄叶片作为阴性对照。

1.2 总RNA和DNA的提取、RT-PCR和PCR

分别根据试剂盒说明从番茄叶片样品中提取总RNA、DNA。TMV、CMV、ToMV、ToCV的检测采用一步法RT-PCR方法，TYLCV的检测采用PCR方法，检测过程参照试剂盒说明书进行，病毒的引物信息见表1[5-8]。扩增结束后，取5 μL PCR产物于1.0%琼脂糖凝胶电泳中检测扩增产物，并用G：BOX SYNGENE全自动凝胶成像系统记录结果，取部分扩增产物送上海生物工程有限公司测序。DNA、RNA提取试剂盒购自TIANGEN公司，一步法RT-PCR反应试剂盒购自康为世纪生物技术公司。

1.3 番茄斑萎病毒的免疫试纸条检测

对表现卷叶、黑斑、环斑等症状的样品，应用免疫试纸条方法进行TSWV的检测。番茄斑萎病毒试纸条购自北京中检葆泰生物技术有限公司，检测步骤参照试剂盒说明进行。

2 结果与分析

2.1 番茄病毒病田间症状

2016—2018年调查河北省番茄病毒病发生情况，样品采集区番茄病毒病发病较严重，田间症状大部分表现为植株矮化，叶片边缘黄化，沿叶脉褪绿（图1a、b）、叶片上卷（图1c），个别植株矮化不明显，叶片表现褪绿、花叶（图1d）。

2.2 侵染河北省番茄的主要病毒种类

对采自18个番茄主产区的346份样品进行PCR及RT-PCR 检测，结果表明，大部分样品中能扩增到约304 bp的特异性条带，经测序比对结果显示，与GenBank中TYLCV序列的相似性高达99.9%，确定该序列为TYLCV的片段;部分样品能扩增出463 bp的特异性条带，经测序比对结果显示，与GenBank中ToCV序列的相似性高达99.48%，确定该序列为ToCV片段;仅博野采集的1份样品中检测到565 bp的特异性条带，经测序比对结果显示，与GenBank中ToMV序列的相似性高达99.8%，确定该序列为ToMV片段。

免疫试纸条检测结果表明，该次检测样品中暂未检测到TSWV的阳性样品。

以上结果表明，该次采样共检测出3种番茄病毒，分别为番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）、番茄褪绿病毒（ToCV）、番茄花叶病毒（ToMV），暂未检测到烟草花叶病毒（TMV）、黄瓜花叶病毒（CMV）和番茄斑萎病毒（TSWV）。其中TYLCV的检出率最高，为63.29%，其次为ToCV，检出率为17.19%，ToMV检出率仅为0.09%（表2）。

2.3 河北省番茄病毒病发生和分布及复合侵染

在河北省8县市18个地区采集的样品中，各调查点均能检测到TYLCV，检出率最高为100%，最低为33.3%;除石家庄栾城、唐山滦南、乐亭、永年外，其他14个地区样品中均检测到ToCV，最高检出率为50%，最低4.17%，所有ToCV均与TYLCV复合侵染，暂未发现ToCV单独侵染的样品。该次检测到的ToMV为单独侵染，仅在保定博野发现1株阳性样品，说明ToMV在河北省发生较轻，仅为零星发生。

3 结论与讨论

该研究对采自河北省8个县市18个番茄主产区的346份样品进行了6种番茄病毒种类的检测，发现目前河北省番茄主产区主要存在3种病毒，分别为TYLCV、ToCV和ToMV，其中TYLCV是分布最广、发生最严重的一种病毒病，田间ToCV主要表现为与TYLCV混合侵染，在不同地区的发病率差异较大，可能与种苗来源有关。TYLCV和ToCV通过烟粉虱传播，因此目前番茄病毒病的防治重点应在于控制烟粉虱的暴发与流行，并加强种苗检疫，减少病毒初侵染源。

该次检测样品中未检测到TMV、CMV，ToMV的检出率仅为0.09%，为零星发生，考虑其原因可能有2个：①以上3种病毒的田间症状主要表现为花叶、蕨叶等症状，在生产过程中，农民对这种症状比较容易辨认，一旦发病会立即拔除，降低了此类病害在番茄产区的流行;②目前大部分主推的番茄品种对TMV、CMV、ToMV的抗性较好，随着这些抗病品种的应用，这类病毒的发生率处于较低水平。

除了以上几种病毒外，TSWV也是该次检测的重点。TSWV可以侵染茄科、葫芦科、豆科、菊科等多种植物，是番茄上一种重要的病毒，目前云南[9]、广州[10]、北京[11]、山东[12]、宁夏[13]等地已有报道。受采样范围所限，该次调查中暂未检测到该病毒在河北省发生。鉴于各地区种子、种苗调运日益频繁，该病毒的传播介体西花蓟马寄主广泛，繁殖力强，田间防治难以有效控制，TSWV传播范围有可能进一步扩大，因此还应加强监测力度，警惕该病毒在河北省的发生。

参考文献

[1] 冯兰香，蔡少华，郑贵彬，等.我国番茄病毒病的主要毒原种类和番茄上烟草花叶病毒株系的鉴定[J].中国农业科学，1987，20（3）：60-66.

[2] 赵世民，李秀生，谈文.番茄病毒病调查及其毒源种类的鉴定[J].河南农业大学学报，1991，25（4）：407-414.

[3] 邸垫平，攻焕然，张书敏，等.河北省发生一种番茄新病害-番茄黄化曲叶病毒病[C]//成卓敏.粮食安全与植保科技创新.北京：中国农业科学技术出版社，2009：207-209.

[4] 孙国珍，高利利，陆文利，等.河北省设施番茄褪绿病毒分子检测和鉴定研究[J].北方园艺，2015（9）：95-98.

[5] 刘玉乐，蔡健和，李冬玲，等.中国番茄黄化曲叶病毒——双生病毒的一个新种[J].中国科学（C辑），1998，28（2）：148-153.

[6] 周莹，尚巧霞，罗晨，等.番茄黄化曲叶病毒的鉴定与群体进化分析[J].植物保护 2016，42（1）：106-111.

[7] 于翠.番茄花叶病毒（ToMV）和黄瓜花叶病毒（CMV）单克隆抗体制备及ToMV在烟草上致病分子机理研究[D].杭州：浙江大学，2004.

[8] 姜玉霞.新疆加工番茄上番茄花叶病毒的分子检测及全序列测定[D].石河子：石河子大学，2008.

[9] 朱敏，王泊婷，黄莹，等.云南天竺葵上发现番茄斑萎病毒[J].南京农业大学学报，2017，40（3）：450-456.

[10] 刘勇，李媛媛，吴竹妍，等.广州辣椒上番茄斑萎病毒属病毒的鉴定[J].植物保护学报，2010，37（4）：383-384.

[11] 李飞，吴青君，徐宝云，等.北京地区发现番茄斑萎病毒[J].植物保护，2012，38（6）：186-188.