农村生活污水高效降解菌的筛选?鉴定及工艺优化

鲁姗 段开红

摘要 [目的]筛选并优化能够降解农村生活污水中有机物的高效降解菌。[方法]利用普遍适用性培养基和选择性培养基进行菌株的分离筛选，以化学需氧量为评判指标进行复筛、鉴定及高效复合菌的初步构建，通过单因素及正交试验优化高效降解菌的发酵条件。[结果]从35株初筛菌株中复筛出5株有机物降解率在40%以上的菌株，最优发酵条件为：接种量0.3%、发酵时间5 d、复合菌的配比B2（假单胞菌）∶N1（棒状杆菌）为4∶1时，有机物降解率可达84.46%。[结论]该研究可为农村生活污水的治理提供参考。

关键词 生活污水;化学需氧量;高效复合菌;优化

中图分类号 X172文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2019）14-0080-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.14.025

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract [Objective] To screen and optimize highly efficient bacteria which can degrade organic matter in rural domestic sewage. [Method] The strains were isolated and screened by universal applicability medium and selective medium. The chemical oxygen demand （COD） was used as the evaluation index for rescreening， identification and preliminary construction of highefficiency composite bacteria. The fermentation conditions of highefficiency degradation bacteria were optimized by single factor and orthogonal test. [Result] Among the 35 strains， 5 strains with more than 40% degradation rate of organic matter were screened out. The optimum fermentation conditions were inoculation amount of 0.3%， fermentation time of 5 days， and the ratio of B2 （Pseudomonas sp.） to N1 （Corynebacterium sp.） was 4∶1， and the degradation rate of organic matter could reach 84.46%. [Conclusion] The study can provide reference for the treatment of rural domestic sewage.

Key words Domestic sewage;COD;Efficient compound bacteria;Optimization

作者簡介 鲁姗（1993—），女，内蒙古通辽人，硕士研究生，研究方向：微生物处理污水。*通信作者，教授，硕士生导师，从事发酵工程研究。

收稿日期 2019-03-04;修回日期 2019-03-19

近年来，随着我国经济实力的快速发展，农村地区生活用水量增加的同时也伴随着污水排放量的急剧增加，农村生活污水如何科学、高效的处理受到了政府及社会各界的重视[1]。《内蒙古自治区农村牧区人居环境整治三年行动方案（2018-2020年）》中也提到了梯次推进农村牧区生活污水治理及科学选择污水处理模式等[2]。所以，寻求适合农村生活污水处理的方法成为当下要务。生物法是污水处理中最常用的技术手段之一，具有成本低、效率高、反应条件温和及无二次污染等显著优点，利用微生物技术处理污水，体现了可持续发展的理念。国内近几年利用微生物处理污水的研究虽然取得一定进展，但国内微生物菌剂的研发仍需加快脚步以改变菌剂针对性不强及效果受多因素影响等问题[3- 6]。

内蒙古巴彦淖尔市五原县塔尔湖镇污水处理厂日平均处理污水350 t。当地生活污水中的主要污染物为淀粉、糖类、油脂、纤维素、蛋白质等无毒有机物，属于生物易降解物质。该试验主要目的是筛选出对农村生活污水具有高效降解能力的菌株，为工业化生产菌种、推广农村生活污水处理技术及降低成本提供参考。为此，笔者试图在塔尔湖镇污水处理厂

的污泥及周边土壤中筛选高效降解菌，以评价污水水质的化学需氧量（COD值）为评判指标进行降解试验，并对高效降解菌的降解性能进行初步研究及工艺优化。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

内蒙古巴彦淖尔市五原县塔尔湖镇污水处理厂周边土壤及厂内处理池中的污水（COD：663 mg/L）、污泥。

电子分析天平（FA1004B，上海佑科仪器仪表有限公司），手提式压力蒸汽灭菌器（DSX-280KB30，上海申安医疗器械厂），恒温培养摇床（HPY-92，上海跃进医疗器械有限公司），高速离心机（HC-3018，安徽中科中佳科学仪器有限公司），电热鼓风干燥箱（DL100，天津市实验仪器厂），生物显微镜（XSP-2CA，上海佑科仪器仪表有限公司），pH计（PHS-3C，上海晶磁仪器有限公司），COD消解装置（COD-571-1，上海仪电科学仪器股份有限公司），化学需氧量（COD）测定仪（COD-571，上海仪电科学仪器股份有限公司）等。

1.2 方法

1.2.1 初筛。采用常用的细菌、放线菌、真菌普遍适用性培养基和筛选固氮菌所用的Ashby无氮培养基及筛选解磷菌所用的无机磷培养基[7]，将污泥及土壤稀释成浓度为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5 g/L的悬液，然后取10-4和10-5 g/L浓度的悬液涂布于筛选培养基相应的固体平板上，选择其中出现时间早、出现次数多及长势好的菌种进一步纯化。

1.2.2 复筛。将纯化后的单一菌株菌悬液（活菌数>108 CFU/mL，LB液体培养基）以1%的添加量接入200 mL灭菌生活污水中，放入25 ℃、140 r/min的摇床中振荡。每24 h测一次COD值，监测周期为120 h。选择COD去除率在40%以上的菌株进行后续研究。

为去除悬浮物的影响，测定COD时需把消解后的待测样品于8 000 r/min离心5 min，取上清液测定COD值。

1.2.3 鉴定。将已分离、纯化的菌株交由上海生工生物工程技术服务有限公司进行16SrDNA测序。将测序结果通过基因数据库（NCBI）进行相似性比对，下载相似性最高序列，采用MEGA7构建进化树。

1.2.4

复合菌的初步构建。将复筛出的、互相之间没有拮抗作用的降解菌，进行等体积随机复配并测定其降解有机物的性能，选择其中降解有机物能力最好的复合菌进行研究。

1.2.5

发酵条件的优化。将降解有机物能力最好的复合菌的菌悬液接入灭菌生活污水中，对接种量、反应时间、复合菌的配比进行单因素试验：接种量：0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、1%、1.5%、2%;反应时间：3、4、5、6、7、8、9 d;复合菌的配比（B2∶N1）：1∶4、1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1。

考虑单因素试验优化得到的结果，建立3因素3水平的正交试验，确定复合菌的发酵条件参数，并根据结果计算极差进行分析。工艺优化正交试验因素水平见表1。

2 结果与分析

2.1 降解性菌株的筛选

2.2 16SrDNA序列分析

通过鉴定结果比对NCBI可知：B1、B4为芽孢杆菌属（Bacillus），B2为假单胞菌属（Pseudomonas），B6为克雷伯氏菌属（Klebsiella），N1为棒状杆菌属（Corynebacterium），Blast比对相似度均为99%。

菌种B1、B4为促生、分解磷钾化合物细菌类菌种，分别为短小芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌，能够分解污水中的磷钾化合物;菌种B2所属的假单胞菌多分布于土壤和水中的各种植物体，有极强的分解有机物的能力，可以将多种有机物作为能源来源，Misiak K等[10]、Su J J等[11]做过关于Pseudomonas knackmussii用于废水处理中膜曝气生物反应器的研究，结果表明假单胞菌在生物法处理污水中具有降解氨氮的能力。菌種B6为产酸克雷伯氏菌，王强等[12]的研究表明其具有降解污水中苯酚的能力;菌种N1为帚石南棒杆菌（Corynebacterium callunae），已有研究报道将该菌种作用于化工污水处理[13]。

2.3 复合菌系的构建 将所筛得的5株降解菌在LB培养基中两两划线观察是否有拮抗作用，发现5株菌之间均无拮抗。将5株降解菌的单菌及随机复配按等体积混合的菌悬液1%的接种量接入灭菌生活污水中反应84 h，每24 h监测一次COD值，采用COD值最低点计算COD去除率，从而确定其降解有机物的性能。结果表示（表3），B2、N1等体积混合处理污水的COD去除率为72.08%，优于单菌及其他复合菌的处理效果。

2.4 发酵工艺的优化结果

2.4.1 单因素试验。根据按所设置的参数将复合菌接入灭菌生活污水中，以化学需氧量（COD值）为评价指标，对其降解污水中有机物能力进行评估。图2～4表明，接种量0.3%时，COD去除率最高;发酵时间5 d，COD去除率最高;复合菌配比（B2∶N1）3∶1时，COD去除率最高;当接种量0.3%、发酵5 d、复合菌配比（B2∶N1）3∶1时，COD去除率为79.24%。

3 结论

该试验共筛选出细菌21株、真菌5株、放线菌10株，且分离出来的菌株对污水中的有机物都有一定的降解作用。复筛出来的5株高效降解菌经鉴定后得出均为细菌，说明细菌是生活污水中的主要降解类群，这与黄世臣等[14]、李德舜 等[15]的研究结果一致。

以化学需氧量（COD值）为评价指标，对5株高效降菌及等体积随机复配的复合菌降解污水中有机物能力进行测定，选择效果最好的单菌或复合菌进行研究;对反应时间、接种量、复合菌的配比3个因素进行考察，通过正交试验进一步确定了复合菌处理污水的最优工艺。结果表明，将菌株B2（Pseudomonadaceae knackmussii）与N1（Corynebacterium callunae）复合降解污水中有机物的效果最好;当反应时间5 d、接种量0.3%、复合菌配比（B2∶N1）4∶1时，有机物降解率达到84.46%。该研究对农村污水的治理具有一定的参考作用。

参考文献

[1] 严岩，孙宇飞，董正举，等.美国农村污水管理经验及对我国的启示[J].环境保护，2008（15）：65-67.

[2]  佚名.内蒙古自治区人民政府关于建立农村牧区人居环境治理长效机制的指导意见[J].内蒙古自治区人民政府公报，2017（14）：5-8.

[3] CHEN Y P，WU C，MA W X，et al.Research progress of sewage treatment technology[J].Advanced materials research，2013，726-731：2576-2579.

[4] 苏月来，谢雨生，张建中，等.有毒难降解有机物废水处理的生物强化技术[J].环境污染与防治，1999（1）：36-39.

[5] 徐承志，周涛，陈柏丽.微生物菌剂的开发和应用现状[J].南方农机，2017（4）：172.

[6] 于宁.我国农村污水处理技术研究进展[J].安徽農业科学，2014，42（11）：3323-3325.

[7] 席娇.荒漠植物的多功能PGPR的分离鉴定及其功能特性研究[D].呼和浩特：内蒙古农业大学，2017.

[8] 杜美，钮朝霞，杨蕾，等.环境水样中生化需氧量测定方法研究进展[J].绿色科技，2016（10）：41-43.

[9] 文娅，赵国柱，周传斌，等.一种新型微生物菌剂处理生活污水[J].环境工程学报，2013，7（5）：1729-1734.

[10]  MISIAK K，CASEY E，MURPHY C D.Factors influencing 4fluorobenzoate degradation in biofilm cultures of Pseudomonas knackmussii B13[J].Water research，2011，45（11）：3512-3520.

[11]  SU J J，YEH K S，TSENG P W.A strain of Pseudomonas sp. isolated from piggery wastewater treatment systems with heterotrophic nitrification capability in Taiwan[J] .Current microbiology，2006，53（1）：77-81.

[12] 王强，马沛生，王加宁，等.一株苯酚降解产酸克雷伯菌的分离与鉴定[J].中山大学学报（自然科学版），2007，46（S1）：56-57.

[13] 李梦娇，彭晟，徐绍忠，等.克雷伯氏菌在农业与环境治理上的应用[J].生物技术进展，2014，4（6）：415-420.

[14] 黄世臣，孙岩，权跃.延吉市生活污水中高效降解菌的分离与筛选[J].延边大学农学学报，2008，30（2）：77-79.

[15] 李德舜，王静，张英，等.城市污水中高效降解菌的分离与筛选[J].山东环境，2000（4）：11-12.