硝基咪唑类抗结核药物结构修饰研究策略

李俊龙， 周 敏， 陈 林， 冯 鑫， 李江红， 石克金， 戴青松， 沈旭东

(成都大学 四川抗菌素工业研究所 抗生素研究与再评价四川省重点实验室， 四川 成都 610052)

0 引 言

结核病是由结核杆菌引起的一种常见的慢性传染病，可累及人体全身各个器官和组织，其中以肺结核最为常见.据世界卫生组织报道，结核病是目前死亡率仅次于艾滋病的全球第二大致死疾病[1].1943年，瓦克斯曼从链霉菌中分离得到链霉素，发现该物质对结核杆菌表现出极强的活性，随后链霉素被成功运用于结核病的治疗.迄今为止，其他一线抗结核药物如异烟肼、利福平等，以及二线抗结核药物氧氟沙星、卡拉霉素等也得以迅速发展.但由于抗结核药物长期的使用，临床应用中出现了治疗周期长、耐多药结核广泛耐药且同时对潜伏状态的结核分枝杆菌作用较弱等诸多问题[2]，同时，结核病也呈现出卷土重来之势.因此，对抗结核药物的开发仍是当前该领域研究的热点.

研究人员发现，硝基咪唑类药物具有良好的抗结核杆菌活性，与传统抗结核药物相比，硝基咪唑类化合物具有全新的抗菌机制及结构[3].其中，具有单环结构的甲硝唑为5-硝基咪唑类药物，仅在厌氧环境中表现出较强的抗结核杆菌活性.1989年，印度Ciba-Geigy公司发现了具有广谱抗结核杆菌活性的先导化合物CGI-17341，这类双环结构的硝基咪唑类化合物对多重耐药结核分枝杆菌具有极强的活性，并对休眠的结核杆菌也有杀灭作用，但其具有较高的基因突变性[4].对此，研究人员在CGI-17341的基础上合成了300多个3位取代的硝基咪唑吡喃类化合物，其中，超过100个化合物具有潜在的抗菌活性.而PA-824就是从这100多个化合物中筛选得到的，尽管它的体外活性不是最高，但在动物感染模型实验中，口服疗效最好，同时具备最佳的药动学特性.该化合物属于第一代硝基咪唑类抗结核候选物，被认为极有开发应用前景.其体外研究结果显示，PA-824与传统抗结核药物联合使用，无交叉耐药现象，且与莫西沙星和吡嗪酰胺联用疗效最为显著.但是，其溶解性较差抑制了PA-824的实际应用，且在细菌诱变分析中，尽管与结构更为简单的CGI-17341相比已经有了显著的降低，但PA-824致突变性仍然保持在相当高的水平上[3].

研究发现，TBA-354化合物的设计的确提高了溶解度，也具有更好的抗菌活性及代谢稳定性，且耐药突变率大大降低，具有比PA-824更强的抗结核分枝杆菌活性与更高的安全性.但在临床试验中，健康志愿者身上产生了神经毒性，所以相关研究于2016年1月停止进行[7-9].通过这些典型案例发现，为了解决此类药物溶解性差、易致突变等不足，研究者们已经做了大量的研究.对此，本研究将对该类化合物结构修饰的研究进展进行详细阐述.

1 母环的修饰

1.1 硝基取代位置的改变

图1 4-硝基咪唑及5-硝基咪唑结构比较

1.2 硝基咪唑环5-位取代基的修饰

相比传统抗结核药物，PA-824具有全新的作用机制.基于该化合物的重要性及独特性，Bollo等[11]通过用溴、氯、氰基、氨基等基团取代咪唑环上5-位碳原子合成一系列PA-824类似物(见图2)，以此来研究硝基咪唑环上的取代基对其抗菌活性的影响.

图2 4-硝基咪唑环5-位取代基的修饰

由于PA-824在细胞内的还原依赖于结核分枝杆菌中一个特殊的硝基还原酶Ddn，Bollo等[11]通过运用电化学方法探索了化合物中硝基阴离子的稳定性.结果发现，咪唑环的不同取代可以很大程度地影响其还原性和硝基阴离子的稳定性.在对具体化合物进一步研究发现，具有富电子基团的硝基咪唑化合物在结核分枝杆菌中不可被还原，但当引入缺电子化学基团后，硝基咪唑环可发生缓慢还原，并且生成稳定的硝基阴离子.同时，研究还发现，通过判断化合物生成一氧化氮是否增多可定性分析其生物活性.此外，当引入溴、氯等原子时，PA-824衍生物的还原依赖于另一种不同于Ddn的还原酶体系，但同时一氧化氮的生成也暗示着与PA-824相同的还原酶体系仍在发挥作用.尽管如此，这一系列PA-824衍生物对于野生型H-37-RV亚型的结核杆菌并没有显著效果，这可能是由于相关的硝基还原酶的空间位阻限制了硝基的还原而使这种电化学的还原无法在细胞内高效地实现.

1.3 母环骨架结构的变换

1.3.2 3-硝基三唑类化合物.

在研究抗肿瘤药物2-硝基咪唑-偶联氯喹啉NLCQ-1的衍生物NLCQ-2时，研究者发现了其在体外表现出对于休眠期的耐多药结核杆菌具有良好的生物活性及选择性的杀菌作用.2017年，Maria等[13]合成一系列3-硝基三唑磺胺类药物，其中很多化合物都具有选择性的抗结核活性，而它们的2-硝基咪唑类似物对于潜伏期的耐多药结核杆菌也具有选择性的抗结核活性.该研究通过筛选这些化合物在好氧或低氧条件下对耐多药结核杆菌H-37Rv杆菌的活性，对耐多药结核杆菌菌株、对小鼠巨噬细胞或THP-1细胞的细胞内活性以及对正常细胞的杀伤活性所获得的体外数据表明，3-硝基-1，2，4-三唑基磺胺类药物在体外具有显著抗结核活性.值得一提的是，这些化合物除了对好氧和低氧耐多药结核杆菌具有活性外，还具有杀菌和细胞内抗结核活性.研究表明，3-硝基三唑基类似物(A)、(B)和(C)(见图4)对好氧耐多药结核杆菌具有选择性作用，并显示出杀菌和胞内活性.而单一耐多药结核杆菌菌株对所有具有较好活性的3-硝基三唑类化合物均不具有交叉耐药性，对好氧耐多药结核杆菌具有活性的化合物则表现出中等至良好的选择性指标.此外，3-硝基三唑基化合物也是非常有效的抗克鲁兹锥虫的药物.因此，该类药物的设计合成为抗耐多药结核杆菌和克鲁兹锥虫复合感染疾病提供了可能的候选药物.

图4 3-硝基三唑类化合物

2 侧链的修饰

2.1 侧链的空间构型修饰

在研究硝基咪唑类抗结核药物的过程中，对于其中具有手性中心的候选药物，Li等[14]合成了具有两个空间构型不同的非对映异构体trans和cis构型，并测试了对应的晶体结构.其研究表明，两种空间异构体对结核分枝杆菌都表现出类似的活性，但两者的水溶性均没有得到改善.其构象分析表明，对于化合物本身及其非对映异构体，这些结构差别较细微的化合物在溶液中都具有相似的空间构象，因而也表现出类似的活性.

2.2 侧链双芳基的结构修饰

2.2.1 双芳基的连接位点对其抗菌活性的影响.

研究证明，典型硝基咪唑类药物其连接的双苯基侧链(见图5)与其生物活性存在相关性，在体外对复制和非复制的耐多药结核杆菌都可显著改善其生物学活性.其中，具有多种双芳基链接方式的化合物，在结核感染小鼠模型中的抗结核活性显著优于母体药物PA-824[15].总体而言，其MIC与侧链取代基的亲电性和吸电子性之间似乎存在一定的相关性.研究发现，化合物抵抗肝脏微生物降解的能力也可能是其体内活性具有差异的原因之一.

图5侧链双芳香基的不同连接位点的结构修饰

2.2.2 双芳基之间连接子的插入.

研究发现，侧链上的双芳基除了可以通过C-C键直接连接外，还可加入不同的基团来完成双芳基的连接(见图6).大多数连接基团在体外耐受性良好，但仍然具有一些不利影响的连接子.例如，磺胺或脂肪族NH的连接基团，这些化合物通常在低氧条件下表现出很差的活性.研究证实，连接子的亲脂性和电子特性都不是影响活性的显著因素.在pH值为7的体系中，连接子为酰胺或磺酰胺基团时可提高溶解度4～6倍，而加入哌嗪或哌啶基团时则仅在低pH值时可提高水溶性至1～2个数量级[16].

图6侧链双芳基之间不同连接子的插入

另外，亲脂性和具有极性的官能基团，例如羧基、烷基胺、哌嗪、哌啶、磺胺等，在体外均可保持良好的生物学活性，特别是当这些连接子与含吡啶环等亲水基团结合后还可以有助于改善其水溶性.研究人员将具有这类连接模式的化合物进行生物学评价时发现，大多数都显示出高的稳定性，在急性期感染小鼠模型中，含吡啶的衍生物在体内活性显著优于母体化合物PA-824，且在慢性感染模型体内表现出优于药物delamanid近24倍的生物活性，并具有良好的药代动力学特征及口服生物利用度.其中，基于这类修饰策略的最优化合物结构在急性感染小鼠模型中表现出优异的抗菌活性，其活性比PA-824高3个数量级，是吡啶连接时的4倍，是可溶性氨基甲酸酯连接的26倍.此类新化合物其具有良好的口服生物利用度(61%)和良好的安全性.但是，其溶解性差且与血浆蛋白结合率高仍然限制了其进一步开发利用[17].此外，当引入苯乙炔，吡啶乙炔等不饱和连接子时，其生物活性均低于PA-824.

2.2.3 以氮杂环取代苯环的结构修饰策略.

以抗结核药物PA-824为基础，科研人员研究了以氮杂环取代苯环(见图7)，来探索联苯—酰基类2-硝基咪唑的氮杂和二氮杂类似物，以期发展一种生物活性更优、毒副作用更低的抗结核候选药物.通过合成实验制备了一种新型的强效双芳基类化合物，旨在通过引入吡啶类官能团以提高水溶性，同时保持高代谢稳定性和有效性.其具体设计思路是用吡啶、吡嗪或嘧啶等取代一个或两个苯基以减少亲脂性.研究发现，通过末端吡啶或近端杂环的引入，在保留了药效的基础上，同时改善了溶解度.特别是在低pH值的情况下，后者显示了更好的体内活性、高代谢稳定性以及出色的药代动力学.而在小鼠急性结核分枝杆菌感染的模型中，科研人员发现了多种类似的化合物比母体药物要好100倍，两种口服生物可利用的吡啶类似物(相比母体化合物，在低pH值环境下，药物溶解度改善了3～4倍)在慢性感染模型中其生物活性优于抗结核药物OPC-67683.

图7侧链芳基的杂环化修饰

研究发现，就联吡啶和吡啶二氮杂环类似物而言，虽然改进了其溶解度(在pH值为7时达到0.7 mg/mL)，但其生物活性较弱.其中，末端苯环被吡啶取代的几种化合物在体外对复制性和非复制性结核分枝杆菌都保持高活性.此外，联苯基和吡啶类相结合的类似物也可以显著改善其溶解度，且在体内和体外都能维持其稳定的抗菌活性.对于后者而言，在末端连接苯环不仅能提高药物的脂溶性，同时也能提高体外抗菌活性及在急性感染期模型中的体内活性[18].

2.3 母环与芳香基之间连接子的修饰

2.3.1 母环与芳基间以醚键为连接子.

Thompson等[19]通过合成不同连接取代的化合物并检测其生物活性发现，具有α-甲基或者去除苄基的亚甲基修饰的硝基咪唑衍生物在体外具有良好的活性.而基于双苯基对于急性期感染结核分枝杆菌的小鼠在其体内表现出优于PA-824近8倍的抗菌活性和高代谢稳定性.其研究表明，利用丙烯基、丙基、戊氧基等延长连接子修饰的化合物对处于复制期的结核杆菌敏感，而丙基醚连接的无论是单分子还是双芳基类似物在厌氧环境下均表现出卓越的抗菌活性.相比苄基苯基和二芳基的衍生物，以OCH2连接子连接时具有最高的抗菌活性.相关研究数据也显示，具有丙氧基连接的化合物不仅在急性期模型中抗菌疗效高于母体药物PA-824近89倍，而且在慢性期模型中，抗菌效果也优于OPC-67683.另外，研究还发现，三氟甲醚吡啶可以提高抗菌活性及水溶性，是具有潜力的候选物.以丙烯基、炔氧基等连接时，衍生物可表现出在有氧环境中对处于复制期的结核杆菌高效的抑制作用.而在单芳基化合物中，丙氧基的连接子改良了其在厌氧环境下的抗菌效果，但其他方式修饰的化合物中仍以甲醚基连接表现出最好的抗菌活性.

2.3.2 咪唑环与芳基间以酰胺类为连接子.

Blaser等[20]研究表明，通过酰胺、氨基甲酸酯和尿素等取代甲基醚连接子可以改善药物水溶性，提高代谢稳定性和安全性，而引入这些连接子能提高2～4倍的抗复制期结核杆菌作用.双芳基化合物在急性结核分枝杆菌感染的小鼠体内具有高于母体药物5倍的抑菌作用，但其水溶性差.用芳基哌嗪取代双芳基不仅保证了其高效的抗菌作用，同时提高药物水溶性，甚至在慢性感染模型中的治疗效果可以与OPC-67683相媲美.此外，延长酰胺后，氨基甲酸酯单芳基化合物在有氧环境下的抗菌作用和安全性得以提高.双芳基侧链系列本身具有高效的抗菌活性，引入酰胺、尿素等连接子后提高了其溶解性，并保证了良好的药物动力学.

2.3.3 咪唑环与芳基间以碳氮键为连接子.

Cherian等[21]基于4-(三氟甲氧乙氧基)苄胺基的亚结构进行了合理衍生化，得到了一系列具有以碳氮键为连接子的结构类似物(见图8).研究发现，

图8母环与芳香基之间连接子的修饰

其具有较高的好氧细胞活性和无氧的全细胞活性.与其母体化合物相比，候选药物的活性均有近10倍的提升.同时，对复制和非复制的结核分枝杆菌进行了全细胞活性测试，通过测试确定了Ddn的动力学参数，降低了其前药的活性.该研究有效拓展了具有碳氮键连接子的各类衍生物，根据定量构效关系研究，合理解释了这类化合物表现出的高抗菌活性，并通过进一步药效学研究确定了该类修饰的化合物在体内具有良好的代谢稳定性和溶解性.

3 结 语

近年来，硝基咪唑类抗结核药的研究取得了一定成果，出现了许多新型及不同作用机制的抗结核候选药物，但是由于其致突变性、神经毒性、溶解性等原因阻碍了这类药物的进一步发展.因此，综合上述结构改造策略以开发新型的硝基咪唑类抗结核先导化合物仍有待开展.具体而言，研究思路可以从以下几个方面展开：首先，在现有的结构基础上，开展更多的结构修饰和衍生，制备大量的化合物，建立更为广泛的化合物库，筛选活性好，毒性低，且更具成药性的先异物；其次，借助有机全合成的方法，构建具有潜在抗菌活性的新型骨架结构，以期得到具有新作用机制的先异物；最后，利用计算机辅助药物设计以及人工智能，结合组合化学及高通量筛选等方法，构建有效的筛选模型，大大缩短药物的开发时间，进而提高药物的开发效率.