响应面法优化响铃草总黄酮提取工艺及体外抗氧化活性研究

李燕，赵天明，黄丽荣，邹涛，吴仙柳

（贵州理工学院，贵州贵阳550003）

响铃草又名马铃草、肾气草等，为豆科植物假地蓝Crotalaria ferruginea Grah.的全草或带根全草，性味微酸、寒，归肺经，具有敛肺气、止咳、消痰、定喘[1]的功效。可用于治疗久咳痰血、耳鸣、耳聋、肾结石、慢性肾炎、膀胱炎、扁桃腺炎、淋巴腺炎、疔毒、恶疮等[2]疾病，主要分布在西南地区，是当地白族、彝族和侗族常用的民间药材。黄酮类化合物是一类存在于自然界的、具有2-苯基色原酮结构的化合物，具有改善血管的通透性、降低血脂和胆固醇的功效，用于治疗心脑血管疾病。总黄酮还具有抗肺癌、前列腺癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌等癌症的功效，其抗肿瘤机制是由于总黄酮具有抗氧化和抗自由基的作用。自由基可损伤正常的细胞和组织，诱发疾病的出现，而天然产物黄酮可以有效对抗自由基以及抑制体内氧化酶的活性[3-4]。另外，总黄酮还具有抗菌、抗炎等活性[5-6]，作用广泛。现代研究也表明，冷水花、仙草和小春花等药材中含有总黄酮化合物，且具有较好的抗氧化活性[7-9]。近年来，随着人们对“绿色消费”、“回归自然”理念的重视，大众对含有植物提取物的食品、药品、保健品、化妆品等产品的认可度不断提升，天然植物提取物的商业价值越来越高，国际上对植物提取物的需求量也越来越大，中国是当今国际上主要植物提取物出口国之一，天然中药材植物提取物占我国植物提取物中比例较大，因此中药材植物提取物前景光明，市场宽广[10]，如何将植物中的有效成分最大限度地提取出来显得尤为重要。闪式提取主要是利用刀片将植物细胞组织进行破碎，同时应用高速搅拌和振动使其有效成分能充分溶解于溶剂中，与传统的回流提取法相比较，闪式提取能够在短时间内让响铃草中总黄酮类化合物快速浸出，将该提取方法运用到响铃草总黄酮的提取研究中大大提高了提取速度，节约了时间。Box-Behnken响应面法是对影响因素进行设计，所得试验结果进行方差分析、回归分析，可实现设计试验、回归分析、预测优化的功能，可用于设计和优化提取工艺参数。目前，响铃草总黄酮提取工艺虽有报道，但本试验采用闪式提取，方法较简单。为了获得较多的总黄酮提取物，并对其生物活性进行检验，本试验通过响应面法优化总黄酮的提取工艺，在最佳提取工艺下进行抗氧化性试验，为响铃草植物提取物的工艺提取、后期开发和利用提供一定依据。

1 材料与方法

1.1 试药

芦丁对照品：中国食品药品检定研究院，批号：100080-201811；VC：上海申博化工有限公司，DPPH：梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；所用试剂为分析纯；水为蒸馏水；响铃草药材：成都荷花池中药材市场

1.2 仪器

UH5300紫外可见分光光度计：日立（中国）有限公司；SD1102D分析天平：塞多利斯科学仪器有限公司；JHBE-50T闪式提取器：河南智晶生物科技股份有限公司；RE-2000A旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂。

1.3 响铃草总黄酮闪式提取工艺优化

1.3.1 总黄酮的含量测定

1.3.1.1 供试品溶液的制备

称取10 g响铃草药材粉末（过5号筛），加入70%乙醇，1∶25（g/mL）的料液比，在闪式提取器中提取90 s，减压抽滤，将滤液至于旋转蒸发仪上，蒸发至无乙醇味为止，所得浓缩液用石油醚进行萃取，直至石油醚层不显示绿色为止，弃去石油醚层，水层为总黄酮提取液，用70%乙醇定容至100 mL容量瓶中，摇匀，即得。

1.3.1.2 对照品溶液的制备

精密称取芦丁对照品10 mg，加70%乙醇溶解，定容至50mL量瓶中，摇匀，制成0.2mg/mL对照品溶液。

1.3.1.3 标准曲线的绘制

精密量取“1.3.1.2”项下芦丁对照品溶液0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，置 10 mL 容量瓶中，分别加入 70%乙醇溶液2 mL，各精密加入5%亚硝酸钠溶液0.3 mL，振摇后放置5 min，精密加入10%硝酸铝溶液0.3 mL，摇匀后放置5 min，再精密加入1.0 mol/L氢氧化钠溶液2 mL，用70%乙醇定容至刻度，摇匀，放置15 min，用与之相应的试剂为空白，于510 nm波长处测定吸光度，记录不同浓度下的吸光度。以芦丁含量（mg/mL）为横坐标（X），吸光度为纵坐标（Y）绘制标准曲线，并计算相关系数（R2）[11]。得回归方程为Y=1.5646X+0.004 8（R2=0.999 3）。

1.3.1.4 重复性试验

精密称药材粉末（过5号筛）6份，按“1.3.1.1”项下进行制备，取 1 mL，置于 10 mL量瓶中，按“1.3.1.3”项下显色后测定各溶液中的吸光度。

1.3.1.5 精密度试验

精密吸取“1.3.1.1”项下的总黄酮溶液1 mL，置于10 mL量瓶中，显色后平行测定6次吸光度。

1.3.1.6 稳定性试验

精密吸取“1.3.1.1”项下的总黄酮溶液1 mL，置于10 mL 量瓶中，显色后，于 0、0.5、1、3、5、7 h 测定吸光度。

1.3.1.7 加样回收率试验

精密吸取6份总黄酮含量已知的供试品溶液1 mL，加入0.2 mg/mL的芦丁对照品溶液适量，显色后测定吸光度。

1.3.2 单因素试验

称取10 g药材粉末（过5号筛）5份，放入提取容器中，每份以1∶25（g/mL）的料液比加入70%乙醇，分别考察在闪式提取器中提取 30、60、90、120、150 s 对响铃草总黄酮提取效果的影响；根据以上方法固定其他因素考察最终所得总黄酮的含量，乙醇浓度分别为50%、60%、70%、80%、90%，料也比分别为1∶25、1∶30、1 ∶35、1 ∶40、1 ∶45（g/mL），从而获得各条件下最佳提取工艺条件。

1.3.3 响应面优化设计

在单因素试验的基础上，选择对总黄酮提取效果影响较大的因素进行试验，本试验选择三因素三水平采用Design-Expert 8.0.6提供的Box-Behnken进行设计，以响铃草总黄酮的含量为响应值。因素水平如表1。

表1 因素水平Table 1 Factors and levels

1.3.4 验证试验

通过Design-Expert 8.0.6软件设计出的方案进行试验，最后得出最优提取工艺进一步进行试验验证，并与预测值比较。

1.4 体外抗氧化性试验

1.4.1 DPPH自由基清除作用

参考文献[12-13]，精密称取DPPH 5 mg，用无水乙醇溶解并定容至100 mL棕色量瓶中，避光保存。以最优条件提取的总黄酮提取液用无水乙醇分别稀释为0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/mL，分别精密量取 2.0 mL总黄酮提取液与2.0 mL DPPH溶液混合摇匀，于室温下反应，静置20 min，作为样品溶液，用无水乙醇调零，样品放入吸收池中，在517 nm处测定吸光度（A1）。对照组为将相同体积的无水乙醇代替总黄酮提取液，按上述条件混合、反应和静置，测定其在517 nm处的吸光度值（A0）。空白组为相同体积的无水乙醇DPPH溶液，按上述方法测定其在517 nm处的吸光度值（A2）。用相同浓度的VC溶液进行上述操作，作为阳性对照试验。计算清除率，清除率/%=[1－（A1－A2）/A0）]×100。

1.4.2 还原力测定

参照文献[14]稍加改进。分别取 0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/mL的总黄酮溶液1 mL，加入2.0 mL pH值为6.6的磷酸盐缓冲溶液和1.5 mL 1%铁氰化钾溶液，摇匀，用恒温水浴锅40℃下水浴30 min，于冷水中快速冷却至室温，加入1.0 mL 10%三氯乙酸，离心，取上清液1 mL置于锥形瓶中，再分别加入1 mL蒸馏水和0.1%三氯化铁溶液，混合，摇匀，在室温下静置10 min，使之充分反应。以无水乙醇代替响铃草总黄酮提取液按上述处理作空白对照，于700 nm处测定吸光度，以吸光度Abs表示还原能力。用同样浓度VC溶液作为阳性对照。

1.4.3 羟自由基清除作用

参照杜丽清等[15]的方法进行响铃草总黄酮羟自由基清除能力进行测定。以最优条件提取的总黄酮提取液用无水乙醇分别稀释为 0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/mL，分别精密量取1.5 mL样品，分别加入1 mL 2.5 mmol/L的水杨酸溶液、1 mL 5 mmol/L的FeSO4溶液、2 mL蒸馏水，摇匀，使之充分混合，再加入1 mL 5 mmol/L的H2O2，置于35℃恒温水浴锅中反应20min，蒸馏水调零，溶液置吸收池中于510 nm波长处测定其吸光度（A1），用相同体积的蒸馏水代替H2O2按上述方法反应后测定吸光度（A2），用同体积蒸馏水代替总黄酮提取液反应后按上述方法测定吸光度（A0）。以同样浓度的VC溶液作为阳性对照。羟自由基清除率/%=[1－（A1－A2）/A0]× 100。

2 结果与分析

2.1 总黄酮的含量测定结果

重复性试验中吸光度的相对标准偏差RSD为1.9%，表明该方法重复性良好；精密度试验中吸光度的相对标准偏差RSD为1.5%，表明仪器精密度良好；稳定性试验中吸光度的相对标准偏差RSD为1.8%，表明总黄酮溶液在显色后7 h内稳定性良好；加样回收率试验中吸光度的平均加样回收率为98.99%，相对标准偏差RSD为1.2%，表明该方法可用于总黄酮的含量测定。

2.2 单因素试验结果

提取时间、乙醇提取分数、料液比对总黄酮含量的结果见图1。

由图1A可知，随着提取时间的增加，响铃草总黄酮含量出现先增加后下降再上升的趋势。当闪式提取时间在90 s时，总黄酮的含量最大，再继续延长提取时间，总黄酮含量反而降低，这可能是由于部分不耐热的黄酮类物质分解，故选择提取时间为60、90、120 s作为响应面设计的因素。由图1B可知，乙醇浓度小于60%时，总黄酮的含量随乙醇体积分数的增加而增大。黄酮类化合物在花、叶、果等组织中一般以苷的形式存在，黄酮苷类一般可用乙醇等溶剂提取；当乙醇浓度高于60%时，总黄酮含量随着乙醇体积分数的增加而降低，这可能是因为乙醇浓度过高，使植物细胞组织外的渗透压过高，影响植物组织中总黄酮的浸出，故选择乙醇浓度为50%、60%、70%作为响应面设计的因素。由图1C可知，随着料液比的增加，响铃草总黄酮的含量出现先增加再降低的趋势。主要是因为随着提取液的增加，响铃草与提取溶剂的接触面增大，利于总黄酮的提取，当料液比超过1∶35（g/mL）时总黄酮含量略有下降，这可能是因为闪式提取器主要依靠机械剪切力和搅拌力使药材有效成分溶解于溶剂中，溶剂过多这两种力受阻，总黄酮的含量会有所下降，故选择料液比为 1 ∶30、1 ∶35、1 ∶40（g/mL）作为响应面设计的因素。

图1 提取时间、乙醇提取分数、料液比对总黄酮含量的影响Fig.1 Effect of extraction time，ethanol concentration，solid-liquid ratio on total flavonoids content

2.3 响应面优化设计的结果

试验设计的结果如表2。

表2 试验设计及结果Table 2 Design and results of tests

采用Design-Expert 8.0.6软件进行设计和拟合后，得多元回归方程为Y=21.56+0.15A+0.27B+0.26C+0.057AB+0.050AC-0.038BC-0.98A2-1.26B2-1.58C2。对响铃草总黄酮含量进行方差分析、方程的显著性检验、系数显著性检验，结果见表3。

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

续表3 方差分析Continue table 3 Analysis of variance

该模型方程有显著意义（P＜0.000 1），失拟项不显著（P=0.087 2＞0.05），说明该回归模型可以充分反应出响铃草总黄酮的提取效果，并作出良好预测。判定系数R2=0.991 2说明模型拟合度好，相关性好，R2adj=0.979 9说明回归模型能较好地反应出因素和因变量的关系，可信度高，可用于响铃草总黄酮最优提取工艺参数的推测和分析。一次项B（乙醇体积分数）、C（料液比）对总黄酮的提取效果影响极显著（P＜0.01），各因素影响程度依次为B（乙醇体积分数）＞C（料液比）＞A（提取时间）；交互项AB，AC，BC对总黄酮的提取效果不显著（P＞0.05）；二次项 A2，B2，C2对总黄酮的提取效果影响极显著（P＜0.01），响应面的分析如图2。

2.4 验证试验结果

图2 各因素响应面图Fig.2 Response surface plots for various factors

通过Design-Expert 8.0.6软件设计出的方案进行试验，最后得出最优提取工艺条件为提取时间92.45 s，乙醇浓度61.10%，料液比1∶35.40（g/mL），预测总黄酮含量为21.591 5 mg/g，根据实际情况，将提取工艺定为提取时间92s，乙醇浓度60%，料液比 1∶35（g/mL）。进一步进行试验验证后，测得总黄酮含量为21.414 2 mg/g，与预测值比较接近，表明该模型准确可靠，能对试验进行准确预测，因此将此提取工艺作为响铃草总黄酮的最优提取工艺参数。

2.5 体外抗氧化性试验结果

体外抗氧化性结果如图3。

图3 体外抗氧化性结果Fig.3 Results of in vitro antioxidant activity determination

由图3可知，响铃草提取物对DPPH自由基、羟自由基的清除率以及还原力随着总黄酮浓度的增加而增强，但其作用效果均低于VC。

3 结论

由于响铃草是全草入药，叶绿素较多，提取过后需要用极性小的溶剂如石油醚将其萃取出，以免影响总黄酮吸光度的测定。响应面法能优化提取工艺参数，对试验结果预测性好，可将影响总黄酮提取效果的各因素与总黄酮的含量进行拟合和线性回归，并预测最优提取条件，方法稳定可靠。本试验在单因素试验下，选择影响总黄酮提取效果较大的因素和水平，采用Box-Behnken响应面法对响铃草总黄酮的提取工艺进行设计和优化，最优条件为提取时间92 s，乙醇浓度60%，料液比为1∶35（g/mL），总黄酮含量为21.414 2 mg/g与预测值接近，说明该方法可靠且预测性好。将最优提取条件下的总黄酮提取液进行体外抗氧化性试验，发现其具有较强的清除DPPH自由基、羟自由的能力，还原力也较高。响铃草为西南地区常用的民族药材，本试验可为响铃草进一步的开发利用提供一定依据。