适于作为食品生产原料的蛹虫草栽培基质的优化

曲星怡 黄登禹 孙永健* 班立桐 曹青青

（1天津天狮学院食品工程学院，天津301700；2天津农学院农学与资源环境学院，天津300384）

蛹虫草（Cordyceps militaris）又名北冬虫夏草，是蛹虫草真菌寄生在鳞翅目昆虫蛹上形成的子座与蛹的复合体[1-3]。目前蛹虫草的大规模工厂化生产中，多以大米作为主要的栽培基质[4，5]。研究发现，蛹虫草的大米培养基中含有丰富的虫草多糖、虫草素、虫草酸等功效成分，以及未被完全利用的大米蛋白、淀粉、膳食纤维等营养成分，可以作为食品、医药、化工等工业生产的原料[6-9]。近年来，许多学者利用采收蛹虫草子实体之后的大米培养基（长满菌丝体）为原料，开发出保健黄酒、功能食醋、风味酱油、焙烤食品等，在提高产品附加值、减少农业废弃物对环境污染的同时，满足人们日益增长的保健需求[10-14]。但蛹虫草栽培基质中除大米外，通常会辅以其他碳源、氮源、无机盐等成分，加之生物富集作用[15-20]。因此，需对其配方进行优化，在保证子实体产量及品质的同时，降低化学污染物残留。研究为提高蛹虫草栽培基质作为原料进行食品开发时的安全性，为扩大其应用前景提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料及设备

蛹虫草菌种为天津天狮学院生物工程专业实验室提供。

蔗糖、蛋白胨、KH2PO4、VB1等均为分析纯，购自天津风船化学试剂科技有限公司；大米、黄豆、蚕蛹粉、玉米淀粉等为市场采购。

光照培养箱（GZX-150BS）、恒温培养振荡器（KYC-100B）：上海圣科仪器设备有限公司；高压蒸汽灭菌锅（MJ-78A）：上海巴玖实业有限公司生产；RZ-2D2G双人桌面（水平）净化工作台：广州瑞智净化设备有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 栽培种制备

称取马铃薯300 g，去皮后切成小块，加500 mL蒸馏水煮沸30 min，用四层纱布过滤取滤液。向滤液中加入 MgSO41.5 g，KH2PO43 g，VB110 mg，葡萄糖20 g，用蒸馏水定容至1000 mL，分装后于121℃下灭菌20 min。

在超净工作台内，挑取绿豆粒大小的蛹虫草菌原种，接种于上述液体培养基中。于摇床内进行避光振荡培养，温度为22℃，转速为120 r/min，3 d后选出菌液澄清、菌球长势一致且无畸形的栽培种继续培养2 d。

1.2.2 培养基配方试验

在前期相关研究的基础上，采用基础基质用量为15 g/瓶，料液比为1∶1.2，栽培种接种量为8 mL/瓶的方案进行培养基的配制与接种。为提升栽培基质作为食品原料进行开发时的利用价值，向常见的大米培养基中添加适量的黄豆或带麸皮的小麦，配方见表1，进行基础基质优选时，培养料中的营养液每升含 有蛋白胨 8 g，蔗糖 7 g，KH2PO41 g，VB10.01 g。为提升栽培基质的食用安全性，基础基质选定后，再对营养液中的碳源、氮源及其他添加物进行优选，以期利用更安全的食品级的碳源、氮源、维生素来替代栽培中常用的蔗糖、蛋白胨、MgSO4、KH2PO4等化学试剂，配方见表2，表3和表4。每个处理进行5个重复。

表1 基础基质配方

表2 碳源的种类及配比

表3 氮源的种类及配比

表4 其他添加物种类及配比

1.2.3 正交试验优化

在1.2.2的基础上，利用正交试验对基础基质的配比、营养液中的碳源、氮源和VC这4个因素进行3水平的设计。其中，L9（34）的9组正交试验中因素与水平的设计见表5。以蛹虫草子实体产量为指标，优化栽培基质配方。

表5 正交试验因素水平

1.2.4 栽培管理

接种好的培养基，于室温17℃避光培养，空气相对湿度保持在65%～75%，待培养基表面布满菌丝后将温度调整为24℃，直至菌丝深入瓶底，吃透培养基。然后进行昼夜温差培养，日间给予600 lx的光照12 h，温度为22℃，夜间避光12 h，温度为16℃，空气相对湿度保持在60%～70%，培养10 d后开始形成原基。随后昼夜给予600 lx的光照，温度固定在22℃，空气相对湿度保持在85%～90%，适当拧松瓶盖，提高空气流通性，促进子实体生长。当子实体尖端稍有膨大时，即可采收。

2 结果与分析

2.1 基础基质配方对蛹虫草培育的影响

按照一定比例向基础基质中添加黄豆比、添加小麦能够明显缩短蛹虫草的栽培用时，最多相差4.2 d。且随着黄豆添加比例的增加，栽培时间逐渐缩短，当添加比例达到20%时，栽培时间最短，平均耗时58.2 d。继续提高黄豆添加比例，栽培时间不降反升。添加小麦的栽培基质，蛹虫草栽培时间随小麦添加量的增加也逐渐缩短，但不如添加黄豆明显。添加小麦对蛹虫草生物学效率的影响并不大，平均生物学效率最高为94.6%。而黄豆的添加对蛹虫草生物学效率有一定影响，平均生物学效率最高为95.3%。添加黄豆可丰富栽培基质的营养成分，增加植物蛋白含量，提高栽培基质作为食品原料进行开发时的利用价值。因此，向大米培养基中添加20%的黄豆为基础基质的较优配方。

表6 采用不同配方基础基质时蛹虫草的栽培用时及生物学效率（n=5）

2.2 碳源对蛹虫草产量的影响

3种碳源均可被蛹虫草菌所利用，但碳源种类及添加量会对子实体的鲜重产生影响且存在差异。其中，以绵白糖（C2组）及玉米淀粉（C3组）为碳源的各处理，子实体鲜重均低于以蔗糖（C1组）为碳源的各处理，无论以何种比例添加，蛹虫草菌更容易利用蔗糖。当营养液中的蔗糖与绵白糖添加量为9 g/L时，蛹虫草子实体鲜重最大，分别为14.2 g/瓶与14.1 g/瓶，两者相差并不大。考虑到采收子实体后栽培基质将作为食品原料进行开发，因此确定绵白糖为较优碳源，营养液中的添加量为9 g/L。

表7 采用3种碳源以不同比例添加至栽培基质后蛹虫草的产量（n=5）

2.3 氮源对蛹虫草产量的影响

以奶粉为氮源的各处理（N31，N32，N33，N34），蛹虫草子实体鲜重均低于以蛋白胨及蚕蛹粉为氮源的各处理。以蛋白胨为氮源时，该试验组中的各处理（N11，N12，N13，N14）对蛹虫草的产量影响不明显。以蚕蛹粉为氮源时，随着添加量的上升，子实体鲜重不断增加，当营养液中添加量为35 g/L时，子实体鲜重最高为14.4 g/瓶。虽然添加蚕蛹粉相比于蛋白胨会增加蛹虫草的培养成本，但可以提高子实体的产量与品质，且在利用采收子实体后的栽培基质作为原料开发食品时，可提升产品的食用安全性，丰富产品的营养成分。综合考虑，确定蚕蛹粉为较优氮源，营养液中的添加量为35 g/L。

表8 采用3种氮源以不同比例添加至栽培基质后蛹虫草的产量（n=5）

2.4 其他添加物对蛹虫草生长的影响

单从蛹虫草生长的各阶段来看，S11处理的栽培基质，适于子实体的生长，所需时间最短，为32.4 d，S12处理的栽培基质，适于菌丝转色及子座原基的形成，所需时间最短，分别为4.2 d与9.8 d。S13处理的栽培基质，适于菌丝体的生长，所需时间最短，为8.8 d。从蛹虫草生长的整个过程来看，添加KH2PO4的栽培基质中（S11，S12），蛹虫草的生长呈先慢后快，其中，S12处理添加了MgSO4，缩短了菌丝转色、子座原基形成所需时间，栽培蛹虫草耗时最短，为56.8 d。添加VC的栽培基质（S13）相比S11、S12处理，虽后期蛹虫草生长趋缓，但整体栽培耗时仍低于S11处理，为57.2 d，仅高于S12处理0.4 d。综合考虑向营养液中添加0.1 g/L的VC为较优的处理。

表9 含有不同添加物的栽培基质中蛹虫草各生长阶段所需时间（n=5）

2.5 栽培基质的优化

以每瓶中子实体鲜重为指标，对基础基质的配比、营养液中的碳源、氮源和VC的添加量进行正交试验优化。结果表明（表9），影响蛹虫草子实体鲜重的主次因素排序为，蚕蛹粉＞黄豆＞VC＞绵白糖。考察这几个因素在3个水平上的变化，确定较优方案为C3A2D2B3，即基础基质的组成及配比为大米80%+黄豆20%，营养液中蚕蛹粉、VC、绵白糖的添加量分别为40 g/L、0.1 g/L、12 g/L。

表10 正交试验直观分析表

在对正交试验结果进行方差分析时，选取绵白糖B作为误差项，在α=0.05的条件下进行F检验，方差分析结果表明（表10），蚕蛹粉、黄豆、VC对蛹虫草子实体的鲜重具有显著性影响，三者变化对蛹虫草的产量影响较大。

以较优方案培养蛹虫草，验证其可靠性，结果表明（表11），子实体鲜重比9组正交试验设计当中的最大值还高，最高达到15.1 g/瓶，相对标准偏差（RSD）为2.05%，进一步验证了正交试验得出的较优方案。

表11 正交试验方差分析

表12 验证试验结果

3 小结与讨论

试验结果表明，在目前应用比较成熟的蛹虫草大米栽培基质中适当添加黄豆和带麸皮的小麦，可以在不影响蛹虫草子实体产量的前提下，缩短栽培时间，且提升栽培基质本身作为食品生产原料的营养价值。同时，黄豆可以提高蛹虫草的生物学效率，从而提高对栽培基质的利用率，这可能是由于黄豆中富含的蛋白质，改善了栽培基质中的碳氮比，使其更适于蛹虫草的生长；以绵白糖作为碳源，以蚕蛹粉作为氮源添加于营养液中，相比于常规蔗糖、蛋白胨来说，可以在不影响蛹虫草产量、保证品质的前提下，提高了后续利用栽培基质作为食品原料开发利用安全性；VC的加入使得初始pH更适于蛹虫草的生长，但对栽培基质的缓冲作用不如KH2PO4好，因此蛹虫草的后期生长变慢，但整体效果仍优于KH2PO4。后续的研究可以寻找一种既可以为栽培基质提供较好缓冲作用，又能提供无机盐营养作用的更安全的添加物。经正交试验优化，最终确定适于作为食品生产原料的蛹虫草栽培基质配方为，基础基质为大米80%，黄豆20%，以1∶1.2的料液比添加营养液、碳源、氮源及其他添加物的较优配方为绵白糖12 g/L，蚕蛹粉40 g/L，VC 0.1 g/L，VB10.01 g/L。