气相色谱-质谱法测定食品中3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩的含量
2019-08-27简德威熊含鸿郑悦珊洪泽淳陈科通讯作者广东省食品检验所
□ 简德威 熊含鸿 郑悦珊 洪泽淳 陈科（通讯作者） 广东省食品检验所
1 引言
3-乙 酰 基-2,5-二 甲 基 噻 吩（3-acetyl-2,5-dimethylthiophene，ADP）是一种可以作为咸味香精的食品添加剂，其于2002年开始被用作食品用香料，常用于肉类食品加工中以赋予食品烤坚果味[1]。2013年，欧洲食品安全管理局（EFSA）对ADP进行安全评估，发现该物质在体内和体外实验均表现出基因毒性，会破坏DNA及细胞中的遗传物质，可能损害人体健康，作为食品用香料使用存在安全隐患[2]，长期使用该物质存在食品安全问题和隐患，易导致食品安全事件（事故）发生。因此，EFSA将ADP从许可香料中剔除，并严禁ADP作为食用香料投放市场或用于食品[3，4]。同年6月14日，欧盟委员会也通过法规Regulation(EC)No 545/2013，禁止将ADP作为食品用香料使用。目前，我国仍允许ADP作为食品用合成香料使用，并收录于国家标准GB 2760-2014[5]中。但是，中国香精香料化妆品工业协会于2013年8月14日发布自律文件(香化协字[2013]62号)，要求香料生产企业不得生产用作食品用香料的3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩，食用香精中不得使用该物质[6]。
目前，国内对3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩的检测没有相应的国家标准。查找相关文献可发现，对ADP的检测方法有液相色谱法[7]、气相色谱-质谱法[8，9]及气相色谱三重四级杆质谱法[10]等。液相色谱法的优点是分离效率高、检测灵敏度高、应用范围广，缺点是定性效果差，容易受到杂质、基质等因素的干扰；气相色谱-质谱法的优点是前处理简单、操作方便、定性效果较好，但在复杂的基质样品中，背景响应较高，致使检测灵敏度降低；气相色谱三重四级杆质谱法的优点是定性更准确、抗干扰能力强、样品基质背景的响应较低、灵敏度也高于单级质谱，更适用于复杂基质中微量、痕量物质的检测[11-13]，但气相色谱三重四级杆质谱法操作较复杂，仪器较昂贵，技术难度较高。
考虑到食品基质复杂和检测技术的难度，采用气相色谱-质谱法测定3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩可以一定程度地避免受到杂质和基质的干扰，且定性效果好、定量准确、操作简便、技术难度较低，因此本研究选择气相色谱-质谱法作为检测方法。
表1 3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩参考保留时间及定性、定量离子
2 材料与方法
2.1 仪器与试剂
2.1.1 仪器设备
GCMS-QP2010Ultra气相色谱-质谱联用仪[配电子轰击（EI）电离源]，日本岛津公司；AB204-S电子天平，瑞士梅特勒-托利多公司；Multifuge X3R离心机，美国赛默飞世尔公司；KQ-500DE超声清洗器，中国科桥公司；Vortex Genius 3涡旋混合器，德国IKA公司。
2.1.2 材料与试剂
正庚烷（色谱纯），康科德科技有限公司；正己烷（色谱纯），康科德科技有限公司；乙醇（色谱纯），康科德科技有限公司；0.45μm有机滤膜，美国PALL公司；3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩标准品（纯度99%），上海Aladdin公司。
2.2 实验方法
2.2.1 标准溶液配制
2.2.1.1 3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩标准储备溶液的配制
准确称取3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩标准品20mg（精确至0.0001g），用正庚烷溶解并定容至10mL，此溶液浓度为2mg/mL。
2.2.1.2 3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩标准中间溶液的配制
将3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩标准储备溶液(2.2.1.1)用正庚烷稀释成浓度为20mg/L的标准工作溶液。
2.2.1.3 3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩标准系列工作液的配制
用正庚烷将标准中间溶液(2.2.1.2)稀释成最终浓度为0.1、0.2、0.5、1.0、2.0mg/L的标准系列工作溶液。
2.2.2 前处理方法
称取1.0g均匀样品（精确至0.0001g）置于50mL离心管中，加入5mL正庚烷，超声提取15min，5000r/min离心5min。然后将提取液转至10mL容量瓶，残渣用3mL正庚烷重复提取一次，合并所有提取液至10mL容量瓶，用正庚烷定容至10mL，过0.45μm有机滤膜，供气相色谱-质谱联用仪分析。
2.3 仪器条件
2.3.1 色谱条件
CP-wax：50m×0.25mm（内径）×0.25μm（膜厚）极性毛细管色谱柱；载气：He，纯度99.999%，流速1.5mL/min；进样口温度：220℃；进样方式：不分流进样；进样量：1μL；升温程序：初始温度50℃保持1min，以20℃/min升温至200℃保持3 min，再以10℃/min升温至220℃保持5min。
2.3.2 质谱条件
电子轰击电离源（EI）；电离能量：70eV；接口温度：225℃；离子源温度：230℃；溶剂延迟时间：5min；测定方式：选择离子监控（SIM）。3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩参考保留时间及定性、定量离子见表1，3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩的质谱图及色谱图见图1、图2。
图1 3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩质谱图
3 结果与分析
3.1 前处理条件的研究
3.1.1 萃取溶剂的研究
图2 3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩色谱图
表2 正己烷、正庚烷、乙醇作为萃取溶剂时的样品回收率
日常检验检测中，实验室大多数使用的低毒萃取溶剂为正己烷、正庚烷、乙醇、异辛烷、二氯甲烷等。本方法选择常用的正己烷、正庚烷、乙醇作为萃取溶剂，以超声萃取方式测试不同基质加标样品的回收率，考察3种溶剂的萃取效率，选择效率最高的溶剂作为萃取试剂，结果见表2。
从表2的检验结果可以看出，使用正庚烷的萃取效率最高，回收率在88.5%～93.5%；其次是乙醇，回收率在79.3%～5.6%；正己烷的回收率最低，只有58.2%～60.5%。考虑到乙醇和水互溶，而带入的水分可能会影响质谱性能，因此选择正庚烷作为萃取溶剂。
3.1.2 萃取方法的研究
常用的萃取方法有超声萃取、涡旋提取、索氏提取等，本方法采用超声萃取、涡旋提取，使用正庚烷为萃取试剂，测试不同基质加标样品的回收率，选取回收率最高的萃取方法作为本方法的最终萃取方法，结果见表3。
图3 不同萃取时间段样品的回收率
从表3的检测结果可以看出，不同基质通过超声萃取的回收率在90.8%～95.3%，均高于涡旋提取的回收率（85.2%～89.9%），因此选择超声萃取作为本方法的萃取方法。
3.1.3 萃取时间的研究
以正庚烷为萃取试剂，通过超声萃取法，研究萃取1、5、10、15、20、30分钟后不同基质加标样品的回收率，结果见图3。
从图3可以看出，随着萃取时间的增加，回收率结果呈现递增趋势，但萃取时间超过15分钟后回收率无明显变化，考虑到检测方法的效率，故选取15分钟作为本方法的萃取时间。
图4 标准曲线图
3.2 方法学验证
3.2.1 标准曲线
通过标准溶液的配制与测定，得出本方法的标准曲线，见图4。
以3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩在0.1～2.0mg/L内呈线性关系，线性回归方程为Y=495019.8X-18840.62，相关系数R2＝0.997。
表3 超声萃取、涡旋提取作为萃取方法时的样品回收率
表4 不同基质计算出的检出限和定量限结果表
表5 不同基质样品加标6次重复测定结果表
3.2.2 方法检出限与定量限
方法的检出限以3倍信噪比（S/N）计算，定量限以3倍检出限计算。通过测定不同基质的低加标含量，可计算出本方法的检出限和定量限，结果见表4。
从表4结果可以看出，计算得到不同基质的检出限分别为0.046、0.048、0.050mg/kg，因此将本方法的检出限定为0.05mg/kg，定量限为0.15mg/kg。
3.2.3 准确性
通过对不同基质加标量为0.5mg/kg的含量测定，研究本方法的准确性，结果见表5。
从表5可以看出，加标量为0.5mg/kg的固体基质样品，重复测定6次的平均值为0.47mg/kg，回收率为94.0%；加标量为0.5mg/kg的半固体基质样品，重复测定6次的平均值为0.47mg/kg，回收率为94.0%；加标量为0.5mg/kg的液体基质样品，重复测定6次的平均值为0.49mg/kg，回收率为98.0%，均符合GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》的要求[14]，说明本方法可准确定量样品中3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩的含量。
3.2.4 重复性
通过对3种不同基质的不同浓度加标含量的测定，计算其回收率和相对标准偏差（RSD），研究本方法的重复性，结果见表6。
表6 不同基质样品3种加标含量回收率结果表
从表6的结果中可以看出，固体基质低加标（0.3mg/kg）6次重复测定的回收率在83.6%～89.3%之间，RSD为2.45%；中加标（0.6mg/kg）6次重复测定的回收率在85.2%～91.7%之间，RSD为2.78%；高加标（1.0mg/kg）6次重复测定的回收率在87.1%～93.3%之间，RSD为2.87%。
半固体基质低加标（0.3mg/kg）6次重复测定的回收率在82.4%～90.2%，RSD为3.90%；中加标（0.6mg/kg）6次重复测定的回收率在86.1%～91.3%，RSD为2.20%；高加标（1.0mg/kg）6次重复测定的回收率在90.9%～100.8%，RSD为3.57%。
液体基质低加标（0.3mg/kg）6次重复测定的回收率在86.2%～94.8%之间，RSD为3.46%；中加标（0.6mg/kg）6次重复测定的回收率在86.7%～91.2%之间，RSD为1.74%；高加标（1.0mg/kg）6次重复测定的回收率在92.1%～101.3%之间，RSD为3.23%。
通过不同基质的不同浓度加标回收率及RSD可以看出，本方法满足GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》的要求[14]。
4 结论
本研究建立了一种气相色谱-质谱法测定食品中3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩含量的检测方法。通过对萃取溶剂、萃取方法、萃取时间的研究，确定了较优且操作简便的前处理条件，并对检测方法的线性、检出限、定量限、准确性、重复性进行方法学验证，确保本方法的结果准确可靠。本研究建立的气相色谱-质谱法测定食品中3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩含量的检测方法，定性效果好、定量准确，且前处理操作简便，技术难度较低，是对目前相对较少的3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩的检测方法的补充，为建立3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩检测的国家标准或方法提供参考依据，同时对执法部门进行食品加工和销售过程中违规、违法添加化学原料行为的监管提供技术支持，避免食品安全事件发生，从而保障食品行业健康发展和人民舌尖上的安全。
