抑制AKT通路对埃克替尼耐药的非小细胞肺癌细胞迁移能力的影响

杨旸，王一喆，郑春雷，侯科佐，王晓楠，胡雪君

（中国医科大学附属第一医院 1.呼吸疾病研究所老年病呼吸感染科；2.肿瘤内科，辽宁省抗肿瘤药物与生物治疗重点实验室，沈阳 110001）

研究［1-2］显示，肺癌是对人类健康威胁较大的恶性肿瘤之一，80%～85%的肺癌为非小细胞肺癌（non-small-cell lung cancer，NSCLC）；NSCLC发 病 率及死亡率逐年攀升。NSCLC发现时往往已为晚期，失去了手术治疗机会，靶向治疗已成为晚期NSCLC治疗的主要方法之一。以吉非替尼和厄洛替尼为代表的表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）—酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitors，TKI）已成为EGFR突变型晚期NSCLC的一线治疗药物。EGFR-TKI类药物明显提高EGFR突变的NSCLC患者的生存率，但耐药问题是阻碍患者疗效的最大障碍［3］。肺癌的首要死因是肿瘤细胞侵袭周围组织和远处转移［4］，近年来的研究［5］表明，NSCLC发生EGFR-TKI耐药后更易发生远处转移。

既往研究［6］表明接受TKI治疗的细胞耐药后往往更容易发生转移，耐药细胞迁移能力增强与其上皮细胞间质化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）表型获得相关，近期研究［7］表明耐药细胞干性表型的增强促进其转移及侵袭，但TKI耐药细胞的转移机制目前尚不十分明确。已有研究［8］表明AKT信号通路活化在介导EGFR激酶抑制剂耐药性方面起关键作用，但其是否促进TKI耐药细胞转移并不十分清楚。埃克替尼是我国第一个拥有自主知识产权的EGFR-TKI，在晚期NLCLC治疗领域发挥良好抗肿瘤作用，目前对于埃克替尼耐药机制尚不十分清楚，2017年有研究［9］表明人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因（gene of phosphate and tension homology deleted on chromsome ten，PTEN）水平降低可能与NSCLC细胞对埃克替尼敏感性降低相关，另有研究［10］表明卡斯塔斯B细胞淋巴瘤谱系B-b（casitas B cell lymphoma-b，CBL-b）低表达介导EGFR突变的NSCLC埃克替尼耐药。本研究探讨抑制AKT通路对埃克替尼耐药的NSCLC细胞迁移能力的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

RPMI1640 培养基（美国Gibco公司），EGFR、p-EGFR、AKT、p-AKT（美国Cell Signaling Technology公司），β-actin抗体（美国Santa Cruz公司），LY294002（美国Cell Signaling Technology公司），埃克替尼（浙江贝达药业公司赠予，药物粉末于DEMSO中溶解，贮存浓度为10 mmol/L，-20 ℃保存）。

1.2 细胞培养

人肺腺癌细胞株PC9购自中科院上海细胞库，PC9细胞株于5%CO2、37 ℃恒温箱内，在含10%胎牛血清（以色列Biological Industries公司）、1%青霉素和链霉素的RPMI1640培养液中培养，2～3 d传代1次。所有实验均采用对数生长期细胞。

1.3 耐药系建立

PC9细胞持续暴露于初始浓度为0.05 μmoL/L的埃克替尼溶液中，并逐渐增加药物浓度，直到药物浓度达到10 μmoL/L。稳定存活于埃克替尼溶液（10 μmoL/L）中的细胞即为耐药细胞（PC9/IcoR）。耐药细胞培养条件：含10%胎牛血清（以色列Biological Industries公司）及1%青霉素和链霉素的RPMI1640培养基置于5%CO2、37 ℃恒温培养箱中，2～3 d传代1次。

1.4 MTT法检测细胞增殖能力

取对数生长期的PC9或PC9/IcoR细胞胰酶消化，以3 000/孔接种于96孔板，置于37 ℃、5%CO2孵箱中培养，待细胞贴壁后加入不同浓度的埃克替尼（0.1、1、10、20 μmoL/L），每种药物浓度设置4个复孔，另设4个溶剂复孔作为对照，培养72 h后每孔加入20 μL MTT（5 g/L），继续培养4 h后吸弃上清，每孔加入200 μL二甲基亚砜，震荡15 min。酶标仪检测570 nm波长的吸光度值，计算抑制率。

1.5 Transwell法检测细胞迁移能力

采用6.5 mm直径、10 μm厚度、8 μm孔径的聚碳酸酯多孔滤膜（24孔板Transwell小室）。将PC9或PC9/IcoR细胞（3.0×104个）悬浮于无血清RPMI1640培养液（200 μL）中，并种植在小室的上层。下室加入含2.5%血清RPMI1640培养液（500 μL）。埃克替尼、LY294002以及埃克替尼与LY294002联用的耐药细胞药物预处理4 h，分别于上室及下室加入相应浓度的药物。小室于37 ℃、5%CO2孵箱中培养24 h后，清洗并风干，小室膜用瑞士吉姆萨染色法染色固定1 h。清洗晾干后显微镜下观察照相，每个小室随机选取3个视野计数，实验至少重复3次。

1.6 Western blotting检测蛋白表达

将细胞冰上裂解，超声离心后取上清，BCA法测定蛋白浓度，并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，湿法转印至硝酸纤维素膜上。5% 脱脂牛奶封闭1 h后分别加入稀释好的1抗4 ℃环境过夜，1×PBS洗涤4次，加入二抗封闭40 min，1×PBS洗涤4次后ECL发光试剂盒显色，凝胶成像系统照相，分析灰度值。

1.7 统计学分析

采用SPSS 16.0统计软件进行数据分析。所得数据均为3次独立实验结果，采用±s表示。2组之间比较采用t检验，P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 埃克替尼对PC9和PC9/IcoR细胞增殖能力影响

结果显示，不同浓度（0、0.1、1、10、20 μmol/L）埃克替尼作用于PC9细胞 72 h，PC9细胞增殖抑制率分别为0、（15.02±3.14）%、（48.13±1.41）%、（64.89±0.96）%、（78.02±2.68）%；与对照组（0 μmol/L埃克替尼）比较，PC9细胞增殖明显抑制（P＜ 0.05），其增殖抑制率随浓度增加而升高。不同浓度（0、0.1、1、10、20 μmol/L）埃克替尼作用于PC9/IcoR 细胞72 h，PC9/IcoR细胞增殖抑制率分别为0、（2.96±0.32）%、（6.08±1.25）%、（9.19±0.83）%、（28.03±9.51）%；PC9/IcoR细胞增殖在不同浓度埃克替尼药物作用下均未受到明显影响（P＞ 0.05），提示PC9/IcoR细胞对埃克替尼的敏感性降低。

2.2 PC9和PC9/IcoR细胞迁移能力比较

结果显示，穿过聚碳酸酯多孔滤膜的PC9细胞、PC9/IcoR细胞数量分别为132.67±14.57、234.33±22.28，2组比较差异有统计学意义（P＜ 0.05）。与PC9细胞比较，耐药细胞PC9/IcoR的迁移能力明显增强。见图1。

图1 PC9细胞和PC9/IcoR细胞迁移能力的比较 瑞氏吉姆萨法×200Fig.1 Comparison of the migration ability between PC9 cells and PC9/IcoR cell Giemsa staining×200

2.3 PC9和PC9/IcoR细胞中相关蛋白表达

Western blotting结果显示，与PC9细胞比较，耐药细胞PC9/IcoR中EGFR和AKT的磷酸化水平均明显升高，提示AKT通路活化可能使耐药细胞迁移能力增强（图2）。

图2 PC9细胞和PC9/IcoR细胞的蛋白表达Fig.2 Protein expression of PC9 cells and PC9/IcoR cells

2.4 LY294002对PC9/IcoR细胞AKT通路的影响

AKT通路抑制剂LY294002（20 μmol/L）作用于PC9/IcoR细胞24 h后，AKT磷酸化水平明显降低；LY294002与埃克替尼（20 μmol/L）联合作用24 h后，AKT通路抑制最明显（图3）。提示20 μmol/L LY294002可显著抑制PC9/IcoR细胞的AKT活化。

图3 抑制AKT对PC9/IcoR细胞蛋白表达影响Fig.3 Protein expression of PC9/IcoR cells after inhibiting AKT

2.5 抑制AKT通路对PC9/IcoR细胞迁移能力的影响

为探讨AKT活化在PC9/IcoR转移中的作用，AKT通路抑制剂LY294002（20 μmol/L）单独或与埃克替尼（10 μmol/L）联合作用PC9/IcoR细胞24 h后，Transwell法检测细胞迁移能力。结果显示，对照组（单纯PC9/IcoR细胞）、埃克替尼组（埃克替尼+PC9/IcoR细 胞）、LY294002组（LY294002+PC9/IcoR细胞）、埃克替尼+ LY294002组（埃克替尼+LY294002+PC9/IcoR细胞）细胞迁移数量分别为234.05±22.61、200.33±20.08、90.45±18.88、19.67±6.42。与对照组比较，埃克替尼组对细胞迁移能力没有明显影响（P＞0.05）；LY294002组可明显抑制细胞迁移能力（P＜0.05）；埃克替尼+ LY294002组对细胞迁移能力的抑制作用更明显（P＜ 0.05）。提示AKT通路活化使PC9/IcoR细胞的迁移能力增强。见图4。

3 讨论

肿瘤转移是一个非常复杂的过程，关于耐药肿瘤细胞的转移机制至今知之甚少，可能与肿瘤微环境改变、细胞内与细胞质基质之间的相互作用、细胞间黏附缺失及肿瘤细胞耐药后干性表型增强有关［11-13］。NSCLC接受EGFR-TKI治疗后发生获得性耐药的细胞系转移及侵袭能力均增强，而且更易获得EMT表型［14］。本研究结果显示，与PC9亲本细胞比较，PC9/IcoR耐药细胞迁移能力明显增强，提示肿瘤细胞的侵袭及远处转移是埃克替尼耐药的特征之一。

图4 抑制AKT对PC9/IcoR细胞迁移能力影响 瑞氏吉姆萨法×200Fig.4 Effect of AKT inhibition on the migration ablity of PC9/IcoR cells Giemsa staining×200

PI3K/AKT通路在细胞生长、分化、增殖和转移中发挥不可替代的作用。研究［15］表明，AKT通路活化促进肿瘤细胞侵袭和转移。已有研究［16］显示PI3K/AKT信号通路在乳腺癌和胰腺癌等多种肿瘤的侵袭和转移中均被活化。PI3K/AKT信号通路抑制剂可以抑制肿瘤细胞的转移和侵袭。AKT通路在不同类型的TKI，包括EGFR-TKI的阻力中发挥至关重要的作用。MET扩增、HGF产生和PIK3CA突变均可以阻断TKI类介导的AKT抑制，进而产生EGFR-TKI耐药。在NSCLC中，PI3K/AKT通路异常活化是EGFR-TKI获得性耐药的原因之一［17］，在肝癌中PI3K/AKT通路活化介导索拉非尼耐药［18］。单独使用AKT通路抑制剂或与吉非替尼联用已证明可以在体外和体内克服HGF介导的吉非替尼耐药［19］。本研究结果显示，与PC9亲本细胞系比较，PC9/IcoR耐药细胞系中EGFR、AKT等蛋白活化水平明显升高，这一现象与耐药细胞系迁移能力增强变化趋势一致，提示AKT活化可能与迁移相关。用PI3K/AKT通路抑制剂LY294002作用于PC9/IcoR耐药细胞系后，AKT通路活性被抑制同时耐药细胞迁移能力明显降低，且AKT通路抑制剂LY294002联用埃克替尼后PC9/IcoR细胞系迁移能力几乎完全抑制。这些结果均说明阻断AKT信号通路可以逆转埃克替尼耐药细胞的迁移。

综上所述，AKT活化促进PC9/IcoR耐药细胞迁移，抑制AKT通路活性可以抑制埃克替尼耐药的NSCLC细胞的迁移。本研究仅从促进耐药细胞迁移角度阐述AKT通路的作用，并未探讨AKT通路活化对PC9/IcoR耐药细胞增殖、凋亡等方面的作用。关于AKT信号通路在埃克替尼耐药的NSCLC中促进迁移的具体机制、AKT通路对耐药细胞增殖、凋亡等方面的影响以及抑制AKT通路能否逆转埃克替尼耐药将在今后的研究中进一步论证。