鼻咽癌组织中S100A8和S100A9的表达与预后的相关性

胡文兵 陶泽璋 费新雄 顾磊 朱苏谨 陈军

1鄂东医疗集团黄石市中心医院（湖北黄石 435000）；2武汉大学人民医院（武汉 430060）

S100蛋白是一种低分子量的酸性钙结合蛋白，与钙离子结合后可以参与细胞信号转导[1]。S100A8和S100A9均为S100蛋白质家族成员，在胞质中通过相互特异性结合形成二聚体复合物S100A8/A9，该二聚体对Ca2+浓度具有一定的依赖性，且具有一定的细胞或组织特异性，可以调节多种蛋白的表达及活性，对细胞迁移、细胞成熟、细胞功能表达等生物学过程均具有明显调控效果[2]。近年来的研究[3]发现S100A8和S100A9在肿瘤细胞的发生和发展中起一定作用，尤其是可以促进肿瘤细胞的转移和诱导免疫抑制。

S100A8和S100A9在不同的肿瘤细胞中具有不同的表达和功能，在鼻咽癌中S100A8和S100A9的表达也高于正常组织[4]，但这两种蛋白在鼻咽癌中的作用尚不完全清楚。本研究采用免疫组织化学方法检测鼻咽癌组织中S100A8、S100A9蛋白的表达，并分析与临床病理特征及预后的相关性来推测其在鼻咽癌中的功能。

1 对象与方法

1.1 研究对象收集2008年1月至2011年12月在武汉大学人民医院、黄石市中心医院耳鼻咽喉科行组织活检首次诊断的92例鼻咽癌患者的癌组织标本。其中男58例，女34例，平均年龄为（50.7±9.4）岁；癌组织分化程度为低分化或未分化的患者74例，中高分化者18例；根据中国鼻咽癌2008年分期标准进行临床分期，Ⅰ～Ⅱ期的患者为48例，Ⅲ～Ⅳ期44例；淋巴结转移63例，无淋巴结转移29例。92例慢性鼻咽炎患者中男55例，女37例，平均年龄（51.4±10.1）岁。两组患者的性别、年龄、体质量等一般情况数据之间相比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。本研究经黄石市中心医院医学伦理委员会批准，患者知情同意。

表1 患者基本资料Tab.1 The basic information of patients ±s

表1 患者基本资料Tab.1 The basic information of patients ±s

项目鼻咽癌组鼻咽炎组χ2/t值P值例数92 92性别（例）男58 55 0.210 0.647女34 37年龄（岁）50.7±9.4 51.4±0.1 0.178 0.859体质量（kg）58.5±5.6 59.2±6.3 0.616 0.539

1.2 病例纳入和排除标准纳入标准：（1）经病理学检查确诊，分期明确；（2）入院前未接受过放疗、化疗及其他抗肿瘤治疗；（3）KPS评分≥70；（4）有完整的临床病理资料。排除标准：（1）合并其他器官肿瘤病史者；（2）合并严重的心、脑、肝、肾等器官原发性疾病者；（3）妊娠或哺乳期女性；（4）不配合随访者。

1.3 免疫组化检测鼻咽癌组织标本经10%甲醛固定，石蜡包埋、切片、脱蜡。将组织切片置于沸腾的柠檬酸缓冲液（pH 6.0）中，微波加热15 min修复抗原，37℃下在3%过氧化氢去离子水中孵化15 min。添加一抗溶液（兔抗人S100A8和S100A9单克隆抗体），在37和4℃孵化60 min，过夜。然后加入二抗溶液（SP试剂盒，Abcam公司，英国），37℃孵化45 min。加入链霉菌抗生物素过氧化物酶，37℃孵育45 min，BAD染色，苏木精染色。上述阳性组织切片用于阳性对照，缓冲液代替一抗溶液用于阴性对照。结果评价：S100A8和S100A9的表达定位于细胞质或细胞核。采用配对评分和半定量评分标准评价结果。评价肿瘤细胞的染色强度和阳性细胞百分率，以染色强度和阳性细胞率的总分作为阳性表达的判断。结果的判读参考陶晓峰等[5]的标准：（1）染色强度评分为：无色0分，淡黄色1分，棕黄色2分，棕黄色3分。（2）阳性细胞率评分：阳性细胞0分＜6%，1分6%～25%，2分26%～50%，3分51% ～75%，4分＞75%。（3）上述两个评分相加：阴性表达（-）0～1分，弱阳性表达（+）2～3分，中度阳性表达（++）4～5分，强阳性表达（+++）6～7分。免疫组化结果由1名副高职称和1名中级职称病理科医师进行双盲阅片，如果出现判定差异，以副高职称人员意见为准，或再请1名副高职称人员阅片。

1.4 统计学方法采用SPSS 22.0软件对数据进行统计学分析。测量结果用平均值±标准差（±s）表示，用t检验进行比较。计数数据的结果以百分比（%）表示，比较采用χ2检验。通过Spearman相关性检验法分析S100A8和S100A9蛋白表达之间的相关性。使用Kaplan-Meier生存分析法分析生存数据。差异结果判定：当P＜0.05时认定差异有统计学意义。

2 结果

2.1 S100A8和S100A9在鼻咽癌组织及鼻咽炎性组织中的表达鼻咽癌组织中S100A8和S100A9阳性表达率分别为52.2%和72.8%，鼻咽炎性组织中的阳性表达率分别为17.4%、37.0%，两组之间S100A8和S100A9表达阳性率相比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表2、图1。

表2 鼻咽癌组织及鼻咽炎组织中S100A8和S100A9表达情况Tab.2 The expression of S100A8 and S100A9 in nasopharyngeal carcinoma and nasopharyngitis例（%）

2.2 S100A8和S100A9表达情况与临床病理的关系S100A8和S100A9表达与患者的性别和年龄无相关性（P＞0.05），而与分化程度、TNM分期和淋巴结转移密切相关（P＜0.05）。见表3。

图1 S100A8、S100A9在鼻咽癌中的表达情况Fig.1 The expression of S100A8 and S100A9 in nasopharyngeal carcinoma

2.3 S100A8和S100A9在鼻咽癌组织中表达相关性分析鼻咽癌组织标本中S100A8的表达与S100A9的表达呈显著正相关性（r=0.4，P＜0.001）。见表4。

表3 S100A8和S100A9表达情况与临床病理的关系Tab.3 The relationship between expression of S100A8，S100A9 and clinical pathology例（%）

2.4 S100A8和S100A9表达与预后的关系根据S100A8、S100A9表达情况，92例鼻咽癌患者分成4组，S100A8（-）S100A9（-）患者（A组）20例，失访1例，实访19例；S100A8（-）S100A9（+）患者（B组）24例，失访2例，实访22例；S100A8（+）S100A9（-）患者（C组）5例，无失访；S100A8（+）S100A9（+）患者（D组）43例，失访5例，实访38例。将各个组患者的生存期情况分析结果绘制成Kaplan-Meier生存曲线，经log-rank趋势检验发现，4个组之间生存时间差异有统计学意义（χ2=10.3，P=0.016）。随后，采用Bonferroni法进行两组间比较，结果显示，A组明显高于D组（χ2=8.4，P=0.004）；而其他各组之间无明显差异（A组vs.B组：χ2=1.9，P=0.2；A组vs.C组：χ2=1.6，P=0.2；B组vs.C组：χ2=0.3，P=0.6；B组vs.D组：χ2=3.3，P=0.069；C组vs.D组：χ2=0.4，P=0.5）。见图2。

表4 鼻咽癌组织S100A8和S100A9表达的相关性分析Tab.4 Analysis of the correlation between expression of S100A8 and S100A9例（%）

图2 S100A8和S100A9表达水平与患者总生存期的关系Fig.2 Overall survival of patients according to the expression of S100A8and S100A9

3 讨论

S100A8和S100A9基因均定位于1号染色体长臂2区1带（1q21区带），1q21-q23区带为恶性肿瘤基因转录的共同激活靶区域，该区带的稳定性极易受到外界刺激、内环境改变以及某些细胞因子水平等因素的影响，易产生缺失、易位等变异情况，研究显示此区域染色体的改变与肿瘤的发生存在一定的关系[6]。研究[7]显示S100A8和S100A9蛋白与多种肿瘤的发生、发展、浸润、转移、复发等存在密切的相关性。

研究[8]显示胃癌中S100A8和S100A9的表达水平明显高于癌旁组织，且与胃癌的黏膜浸润、淋巴结转移、细胞的侵袭性存在明显的相关性。有研究[4]通过免疫组化、ELISA和 Western-blot等多种方法对鼻咽癌中S100A8和S100A9蛋白表达水平进行检测，显示其水平均明显高于正常组织。但是，也有研究结果显示S100A8和S100A9蛋白在低分化食管鳞癌细胞和宫颈鳞癌细胞中的表达水平是显著低于正常组织[9]。本研究中，笔者使用免疫组化方法分别检测S100A8、S100A9在鼻咽癌组织和鼻咽炎性组织中表达情况，结果显示S100A8和S100A9在鼻咽癌组织中的阳性表达率显著高于鼻咽炎性组织（P＜0.05），并且S100A8和S100A9的异常高表达与鼻咽癌的性别、年龄无密切的关系（P＞0.05），而与鼻咽癌的分化程度、TNM分期和淋巴结转移情况密切相关，表明随着鼻咽癌侵袭能力的增强，S100A8和S100A9的表达水平也明显增加，推测S100A8和S100A9在肿瘤的侵袭中发挥作用。LIM等[10]研究认为，转移性肝癌微环境中的单核细胞/巨噬细胞通过诱导肿瘤细胞高表达S100A8和S100A9蛋白、促进肿瘤细胞的增殖和血管生成等多个相互独立的机制来增强肝转移瘤的侵袭能力，而阻断S100A8或S100A9蛋白的表达可以减低组织培养中细胞的迁移和侵袭潜力，以及体内肝转移瘤的形成和其中肝细胞的转移侵袭，可见S100A8和S100A9是肿瘤细胞具备侵袭性的重要蛋白。

S100A8的表达与S100A9的表达呈正相关，提示两者在鼻咽癌的形成和发展过程中可能具有协同作用。S100A8和S100A9以钙依赖的方式形成S100A8/A9异质二聚体复合物[11]，其中S100A8是主要的生物活性蛋白，发挥其生物学功能，而S100A9通过调节S100A8来保证其功能的稳定性[12]。NISHIMURA 等[13]认为，S100A8、S100A9 蛋白及S100A8/A9二聚体对细胞的侵袭及迁移具有明显的调控效果。LIU等[14]研究发现S100A8在肝癌细胞系中的过度表达，导致细胞增殖、迁移、侵袭能力加强和肿瘤生长的增快，在肝癌组织中的S100A8甲基化水平低于相邻正常组织，且低甲基化与总生存期缩短和无进展生存期相关，S100A8可能在肝癌中作为肿瘤启动子发挥一定作用。本研究以S100A8和S100A9表达情况分组作生存曲线发现，S100A8（+）S100A9（+）患者5年生存率最低，S100A8（-）S100A9（-）患者5年生存率最高。虽然S100A8和S100A9表达均为阴性者的生存率与其中之一表达阳性者的生存率相比较差异无统计学意义，但生存率曲线图仍然可以观察到有分开的趋势。生存分析结果表明，S100A8、S100A9表达阳性患者的预后比S100A8、S100A9表达阴性患者的预后差，提示S100A8、S100A9的表达可作为鼻咽癌预后的预测因子。

总之，S100A8和S100A9在鼻咽癌组织中的表达升高，两种蛋白的高表达提示患者预后不良，与鼻咽癌的严重程度呈相关性，可作为鼻咽癌临床治疗及预测预后的重要指标，但具体机制仍有待进一步研究。