R-脊椎蛋白1表达与Wnt/β-catenin信号通路在乳腺癌中的相关性及临床意义

刘少杰 陈腾腾 陈晓越 薛秀芬 朱影玲

广东省惠州市中心人民医院1乳腺外科，2病理科（广东惠州 516001）

乳腺癌的发生已位居女性恶性肿瘤的首位。笔者前期研究发现R-脊椎蛋白（RSPO1）的高表达与乳腺癌的发生发展密切相关，且与乳腺癌细胞侵袭和转移呈正相关[1-2]。有研究[3]表明，Wnt/β-catenin信号通路在乳腺癌组织中存在过度激活，且与癌细胞的生长、增殖、迁移有关。关于RSPO1与Wnt/β-catenin信号的临床病理相关性研究未见报道，笔者通过检测RSPO1、SFRP1和β-catenin在非特殊型乳腺浸润性癌（breast invasive carcinoma of no specific type，BIC-NST）和乳腺导管原位癌（breast ductal carcinoma in situ，BDCIS）中的表达，探讨其与临床病理参数的关系，为BIC-NST的临床预测、控制肿瘤进展提供新的靶点和治疗策略。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集惠州市中心人民医院2009年1月至2015年12月224例BIC-NST、155例BDCIS及癌旁正常组织（normal breast tissues adjacent to carcinoma，NBTAC）379例，参照2012年WHO乳腺肿瘤Bloom-Richardson改良标准进行BIC-NST的组织学分级及pTNM分期；BDCIS分为低级别、中等级别和高级别3级（结合肿瘤坏死、细胞极向和细胞核特征）。取距癌组织＞0.5 cm的正常乳腺组织作对照[1]，将BDCIS的癌旁正常组织155例用NBTAC1表示，BIC-NST的癌旁正常组织224例用NBTAC2表示。所有患者病理资料完整，入院前未进行任何化疗和放疗。患者知情同意并告知标本只用于科学研究（患者知情同意书由惠州市中心人民医院伦理委员会鉴定批准，并由科教部管理存档）。

1.2 试剂与方法兔抗RSPO1多克隆抗体（购自英国abcam公司，ab231125）、兔抗SFRP1单克隆抗体（购自英国abcam公司，EPR7003，ab126613）、兔抗β-catenin多克隆抗体（购自美国Santa cruz公司）和羊抗兔二抗（购自北京中杉金桥生物技术有限公司），SP及二氨基联苯胺（DAB）显色试剂盒（购自福州迈新生物技术开发有限公司）；每组免疫染色分别设立阳性和阴性对照，采用免疫组化SP法，按说明书进行实验操作。

1.3 制作组织芯片采用Quick-Ray tissue microarray system，选取目标石蜡标本的所需区域，供者蜡块37～40℃孵育15～20 min，用转移器抽提目标蜡块组织，并缓慢转移至受者蜡块的相应孔内（4 mm深度，直径2 mm×60孔），并做好每孔病例标记和记录，组织芯片置于包埋盒中70℃烤30～60 min，至完全透明后包埋，-20℃硬化后备用。每个病例采用3个复孔用于评价。

1.4 免疫组化SP法将组织芯片的白片65℃烤60 min，二甲苯、梯度乙醇脱蜡至水，3%H2O2孵育15 min，0.1%枸橼酸缓冲液高压抗原修复，滴加兔抗一抗RSPO1、SFRP1和β-catenin（浓度1：100稀释），4℃冰箱过夜，PBS×3次，滴加山羊抗抗兔二抗（50 μL），常温孵育40 min，DAB显色，显微镜下观察并及时终止显色，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。每批染色均用同源抗体做阴性对照。

1.5 免疫组化结果判定标准所有免疫切片由2名病理医师双盲独立重复阅片，采用同一评价方法，分别评价BIC-NST和BDCIS的RSPO1、SFRP1、β-catenin表达，对同时含有BIC-NST和BDCIS的病例分别进行评价（约有20%的BIC-NST病例同时伴有BDCIS），对于BDCIS伴微小浸润的病例按BDCIS来评价，当整张切片表达的着色强度存在异质性时，以整张切片表达最强（＞10%）的部位来评价。判断标准具体如下：根据染色面积分别评分：0分：≤ 5%，1分：5%～24%，2分：25%～49%，3分：50%～74%，4分：≥75%；根据着色强度分别评分：1分：弱阳性，2分：中等阳性，3分：强阳性。总分=染色面积×着色强度，总分≥5分为高表达，≤4分为低表达。

1.6 统计学方法采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析：RSPO1、SFRP1和β-catenin在BIC-NST及BDCIS组织中的表达比较，以及各临床病理参数组间表达的差异性比较均采用卡方检验，组间的相关性分析采用Spearman分析，所有P值采用双侧检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RSPO1、SFRP1和β-catenin在BIC-NST及BDCIS中的表达RSPO1蛋白定位于细胞膜与细胞质，以细胞浆阳为主，呈棕色颗粒分布（图1A～C）；SFRP1蛋白定位于细胞膜与细胞质，以细胞膜阳为主，呈棕色颗粒分布（图1D～F）；β-catenin蛋白定位于细胞浆和细胞核，以细胞核阳为主，呈棕色颗粒分布（图1G～I）。RSPO1和β-catenin在BICNST及BDCIS组织中的表达明显高于癌旁正常组织（P＜0.01），而SFRP1在BIC-NST及BDCIS组织中的表达明显低于癌旁正常组织（P＜0.01）。RSPO1和β-catenin在高级别BDCIS的表达率明显高于低级别组（P＜0.01），在Ⅲ级BIC-NST分化组的表达率明显高于Ⅰ级分化组（P＜0.05），而且组织分级越高，RSPO1和β-catenin表达越高，呈明显的正相关（P＜0.05）；但SFRP1在Ⅲ级BIC-NST分化组的表达率明显低于Ⅰ级分化组（P＜0.05），而且组织分级越高，SFRP1表达越低，与RSPO1和β-catenin呈明显的负相关（P＜0.01）；在BDCIS组织中SFRP1表达与分级不相关（表1）。

图1 RSPO1、SFRP1、β-catenin在乳腺各组织中的表达情况（× 400）Fig.1 Expression of RSPO1，SFRP1 and beta-catenin in breast tissues

表1 NBTAC、BDCIS和BIC-NST组织中RSPO1、SFRP1和β-catenin蛋白表达的阳性表达率Tab.1 The positive of expression rate of RSPO1，SFRP1 and β-catenin protein in NBTAC，BDCIS and BIC-NST tissues

2.2 RSPO1、SFRP1和β-catenin在BIC-NST及BDCIS中表达的相关性在BIC-NST组织中，RSPO1与β-catenin呈正相关（r=0.114，P=0.023），SFRP1与β-catenin呈负相关（r=-0.132，P＜ 0.001），RSPO1与SFRP1呈负相关（r=-0.217，P=0.011）（表2、3）。

表2 RSPO1、SFRP1与β-catenin蛋白表达在BDCIS及BIC-NST中的相关性分析Tab.2 The correlation between the expression of RSPO1，SFRP1 andβ-catenin protein in BDCIS and BIC-NST

表3 RSPO1与SFRP1蛋白表达在BDCIS及BIC-NST中的相关性分析Tab.3 The correlation between the expression of RSPO1 and SFRP1 protein in BDCIS and BIC-NST

2.3 BIC-NST组织中RSPO1、SFRP1和β-catenin的表达与临床因素的关系RSPO1和β-catenin表达在患者临床分期Ⅲ+Ⅳ期中的表达明显高于Ⅰ+Ⅱ期的表达（P＜0.01），与淋巴结转移、脉管浸润相关（P＜0.01），但与年龄、肿物大小不相关；SFRP1表达在患者临床分期Ⅲ+Ⅳ期中的表达明显低于Ⅰ+Ⅱ期的表达（P＜0.01），与淋巴结转移及脉管浸润相关（P＜0.01），但与年龄、肿物大小不相关（表4）。

3 讨论

研究发现R-脊椎蛋白（RSPO）在肿瘤发生发展中发挥了重要作用。据报道RSPO1/LGR5与结肠癌细胞中的TGFβⅡ型受体协同直接激活TGFβ信号传导，增强TGFβ介导的生长抑制和应激诱导的凋亡，抑制结肠癌转移，并在体内原位结肠癌模型中也得到了验证[4]。在卵巢癌中，RSPO1在癌细胞和癌组织中表达上调，通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进癌细胞存活，生长和耐药[5]。此外研究[6]发现RSPO2-GPR48/LGR4通路的上调通过促进ERK磷酸化促进乳头状甲状腺癌的肿瘤侵袭性，为治疗分化型甲状腺癌提供了一个新的治疗靶点。

研究报道，乳腺癌中RSPO蛋白与经典Wnt通路配体类似，通过激活和与Wnt配体等协同激活Wnt/β-catenin信号通路来参与调控细胞的增殖和分化[7]。本研究，RSPO1在BIC-NST及BDCIS组织中明显高表达，RSPO1在高级别BDCIS和Ⅲ级BICNST中的表达率明显高于低级别BDCIS组和Ⅰ级BIC-NST分化组，且组织分级越高，RSPO1表达越高。有研究也证明，小鼠乳腺肿瘤病毒（MMTV）模型中存在RSPO2和RSPO3基因的过度激活，且RSPO蛋白可调控Wnt/β-catenin 信号通路[8]；Wnt1、RSPO2高表达可促进裸鼠乳腺上皮细胞的恶性转化及乳腺癌细胞的上皮间质转化（EMT）、侵袭和转移[10]。可见，RSPO可促进乳腺上皮细胞癌变，且RSPO和Wnt蛋白在激活Wnt/β-catenin信号通路中起正协同作用。本研究结果也提示在BIC-NST组织中，RSPO1与β-catenin正相关；且RSPO1和β-catenin表达在患者临床分期Ⅲ+Ⅳ期中的表达明显高于Ⅰ+Ⅱ期的表达，与淋巴结转移及脉管浸润密切相关。

MATSUDA等[10]研究发现在乳腺癌MDA-MB-231细胞中上调SFRP1能阻断Wnt/β-catenin信号通路，从而减少肿瘤细胞增殖，并且抑制异体移植小鼠模型中肿瘤的生长和转移。本研究，SFRP1在BIC-NST及BDCIS组织中明显低表达，SFRP1在Ⅲ级BIC-NST分化组的表达率明显低于Ⅰ级分化组，且组织分级越高，SFRP1表达越低；SFRP1在临床分期Ⅲ+Ⅳ期患者组织中也明显低表达，且与淋巴结转移及脉管浸润相关。KLOPOCKI等[11]研究发现低表达SFRP1，可显著降低SFRP1对Wnt信号通路的抑制作用，促使Wnt信号通路异常活化，导致BIC-NST的进展。本研究，BIC-NST组织中SFRP1与RSPO1和β-catenin呈明显的负相关，但在BDCIS组织中SFRP1表达与分级不相关，进一步表明，BICNST与BDCIS具有不同肿瘤发生学和遗传表型。

表4 BIC-NST组织中RSPO1、SFRP1、β-catenin蛋白表达及其与临床病理参数的关系Tab.4 The relation between the expression of RSPO1，SFRP1，β-catenin protein in BIC-NST with clinical pathological features例

综上所述，高表达的RSPO1、β-catenin蛋白和低表达SFRP1蛋白与BIC-NST细胞的增殖分化、侵袭及转移密切相关，RSPO1与β-catenin正相关，而SFRP1与β-catenin、RSPO1之间存在负相关调节作用，RSPO1、SFRP1与β-catenin蛋白是与乳腺癌细胞侵袭、转移相关的分子标记物，联合检测是否可以成为乳腺癌患者独立的预后及监测指标仍需要进一步探讨和研究。