督脉电针对APP/PS1双转基因痴呆小鼠皮层细胞形态及APP、BACE1蛋白表达的影响*

邵淑君，邬继红△，唐银杉，高誉珊，张淑静，向杜炼

(1.北京中医药大学，北京 100029；2.浙江大学医学院附属第二医院，浙江 杭州 310009)

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是最常见的神经性皮质痴呆，是造成老年人痴呆的最常见原因。AD患者多伴有学习记忆障碍，且易受情绪波动的影响，严重者晚期生活不能自理，极大程度上威胁老年人的生活品质[1]。相关研究表明，近年来发达国家的痴呆发病率逐年趋于稳定[2]，但发展中国家的痴呆发病率仍然呈现逐年上涨的趋势[3]，给社会经济的发展造成了极大的负担和压力。

老年斑(Senile plaque，SP)又称神经炎性斑块，是AD病理诊断的重要标志物分子。β-淀粉样蛋白(β-amyloid protein，Aβ)是老年斑的主要成分，Aβ具有神经毒性，当其含量升高时，诱导淀粉样斑块和神经元损伤的形成[4]，加速细胞凋亡。淀粉样前体蛋白β-分泌酶1(β-amyloid cleaving enzyme，BACE1)是一种启动Aβ产生的跨膜型天冬氨酰蛋白酶，通过异常切割淀粉样蛋白前体蛋白(Amyloid precursor protein，APP)，使Aβ在脑内的沉积增加或清除减少[5-6]。

本次实验以7月龄APP/PS1双转基因小鼠为模型，观察电针“百会”“印堂”“人中”穴对皮层细胞形态的影响，并检测皮层APP、BACE1的表达情况，以探求电针治疗AD的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物与分组

购入7月龄雄性SPF级APP/PS1双转基因小鼠30只，体质量(30±2)g。采用随机数字表法将其分为模型组、电针组和药物组，每组10只。相同遗传背景的C57BL/6小鼠10只作为正常对照组。以上实验动物均由北京华阜康生物科技股份有限公司提供[许可证号：SCXK(京)2014-0004]。于北京中医药大学动物中心屏障系统单笼饲养，实验前适应性的喂养1周，自由进食进水。

1.2 主要仪器与试剂

生物组织自动包埋机(浙江金华益迪医疗设备厂，货号：YD-6L);自动化智能型正置研究级显微镜(中国Olympus公司，货号：BX53);稳压稳流电泳仪(美国Bio-Rad公司,货号：PowerPacTM1645050);垂直电泳槽(美国Bio-Rad公司,货号：Mini-PROTEAN Tetra System 1658999);化学发光凝胶成像系统(美国Azure Biosystems公司，货号：C600);常温高速离心机(德国Eppendorf公司，货号：5702);台式恒温振荡器(江苏太仓实验设备厂，货号：THZ-D);酶标仪(美国Thermo公司，货号：MK3);HANS-LH202型韩氏电针仪(南京济生医疗科技有限公司);无菌针灸针(规格为0.25 mm×13 mm,北京中研太和医疗器械有限公司)；病理级载玻片(江苏世泰实验器材有限公司，货号：10127105P);SP600125(美国Sigma公司，货号：420119);多聚赖氨酸(福州迈新生物技术开发有限公司,货号：GLU-0040);PBS磷酸盐缓冲液(福州迈新生物技术开发有限公司,粉剂，货号：PBS-0060);枸橼酸盐缓冲液(福州迈新生物技术开发有限公司,粉剂，货号：MVS-0066);ECL发光液(北京索莱宝科技有限公司,货号：PE0010);Tris-甘氨酸电泳缓冲液(北京索莱宝科技有限公司,货号：T1070);电泳转移缓冲液(北京索莱宝科技有限公司,货号：D1060-500);TBST缓冲液(北京索莱宝科技有限公司,货号：T1081-500);鼠抗单克隆APP抗体(美国Millipore公司,货号：MAB348);PVDF膜(美国Millipore公司,货号：C3117);兔抗单克隆BACE1抗体(美国Abcam公司，货号：ab183612);β-actin一抗(北京中杉金桥生物技术有限公司，货号：TA09);抗兔二抗(北京博奥森生物技术有限公司,货号：bs-40295G)；抗小鼠二抗(北京博奥森生物技术有限公司,货号：bs40296G);一抗稀释液(上海碧云天生物技术有限公司，货号：P0023A)。

1.3 干预措施

鼠套制作：材料：纸板、灰色纱网、透明胶带、订书机。将纸板裁剪成小鼠大小(7 cm×9 cm)，纸板顶部按照小鼠头型剪成弧形，用透明胶带将纸板缠绕包裹两圈，防止针刺时鼠尿浸湿纸板。将黑色纱网双层覆盖在纸板上，用订书机沿纸板边缘订在纸板上，纱网的活动度以两手指可伸入至顶部为最佳。束缚时，使小鼠钻入鼠套，仅尾部暴露在纸板外，迅速用活动夹固定住纸板边缘，防止小鼠在鼠套内翻转。见图1。

图1 自制鼠套

电针组：选取“百会”“印堂”“人中”(参照“十一五”《实验针灸学》第2版)，用自制鼠套进行束缚，将穴位和针具进行常规消毒，使用无菌针灸针进行针刺干预，“百会”“印堂”皆向下平刺进针，两针互不触碰，进针深度为0.2～0.3 cm，针柄接电针治疗仪，电针输出频率设置为1 Hz，电流强度为1 mA，每次干预20 min后快速点刺“人中”，隔天针刺干预1次，共15次。

药物组：每次束缚前30 min进行腹腔注射SP600125溶液，由2%DMSO溶液配制而成，按30 mg/kg进行腹腔注射，在电针组治疗时，采用同等强度的束缚干预，20 min/天，隔天1次，共15次。

对照组：在其他治疗组治疗的同时，抓取1次，并用相同规格的鼠套进行束缚干预，20 min/天，隔天1次，共15次。

模型组：同正常对照组。

1.4 脑组织取材

电针干预结束后，水合氯醛20 g/0.1 mL腹腔麻醉小鼠，进行取材。随机的从每组选取3只小鼠，打开胸腔，充分暴露小鼠心脏，将灌注针头经左心室插入升主动脉，同时剪开右心耳，快速滴注100 mL生理盐水，至小鼠肝脏完全变白以及右心耳流出澄清的液体后，再快速灌注4%多聚甲醛，至小鼠的肢体和尾巴僵硬后，立刻断头取出全脑，迅速将脑放入固定液(4%多聚甲醛)中，6 h后将皮层组织进行石蜡包埋，用于HE染色，切片厚度为5 μm。每组剩下的7只小鼠直接提取皮层蛋白置于EP管中，迅速冻存于-80℃环境，待WB检测用。

1.5 指标检测

1.5.1 HE染色观察小鼠皮层神经细胞形态变化 二甲苯脱蜡，3×15 min；100%乙醇(Ⅰ)5 min，100%乙醇(Ⅱ)5 min，95%乙醇5 min，90%乙醇5 min，80%乙醇5 min,70%乙醇5 min；蒸馏水洗3×3 min；苏木素染色3 min；1%盐酸乙醇分化数秒；自来水冲洗1 min；伊红复染30 s；自来水冲洗2×5 min；90%、95%、100%乙醇梯度脱水；二甲苯干燥2×15 min；中性树胶封片。光学显微镜下观察小鼠皮层神经细胞形态的变化，并拍照。

1.5.2 蛋白免疫印迹法(Western blot)检测皮层APP、BACE1蛋白含量 每组其余7只小鼠取新鲜皮层组织，称重，迅速放入1.5 mL离心管，加入100 mg/mL裂解液(10%上清)，冰上研磨。冰上放置20 min，每隔5 min用旋涡仪震荡混匀。然后行4℃离心10 min，10 000 rpm，吸取上清。BCA法测定组织蛋白含量，制备蛋白样品。配置10%SDS-PAGE凝胶，每孔加样10 μL，初始电压为80 V，20 min，待溴酚蓝燃料进入分离胶上缘后提高电压至100 V，60 min。湿转80 V，90 min至PVDF膜；转膜后以5%TBST脱脂奶粉封闭，室温震荡60 min。封闭结束后，加入一抗APP抗体(以1∶2 000一抗稀释液稀释)，一抗BACE1抗体(以1∶2 000一抗稀释液稀释)室温孵育过夜。TBST洗膜，3×10 min。TBST0.5%脱脂奶粉孵育二抗(以1∶2000TBST稀释)60 min，TBST洗膜，3×10 min。将PVDF入ECL(1∶1混)超敏发光液中曝光，观察条带，以β-actin作为蛋白内参。采用Image-J software分析扫描后目的条带的灰度值。

1.6 统计方法

2 结果

2.1 各组小鼠皮层细胞形态HE染色结果

对照组皮层神经细胞染色清楚且均匀，细胞排列整齐，神经元数量多，细胞核呈圆形，核仁清晰；模型组皮层神经细胞排列散乱，整个细胞染色不均匀，多数细胞胞核固缩，核仁不清晰；与模型组比较，电针组神经细胞排列较为规则整齐，核固缩现象明显改善，药物组核固缩现象略为改善，说明电针能有效缓解神经细胞损伤和核固缩现象。见图2。

图2 各组小鼠皮层神经细胞表达(HE染色，200×)

2.2 各组小鼠皮层APP、BACE1蛋白western blot的表达结果比较

与对照组比较，模型组皮层APP、BACE1蛋白表达水平显著升高,差异有统计学意义(均P<0.01)；与模型组比较，电针组APP、BACE1蛋白表达水平降低，差异有统计学意义(均P<0.05)；与模型组比较，药物组APP蛋白表达呈现下降趋势，但差异无统计学意义，BACE1表达降低，差异有统计学意义(P<0.05)。提示电针和药物SP600125均能降低APP/PS1痴呆小鼠皮层APP、BACE1蛋白水平，但电针效果优于SP600125。见图3。

注：与对照组比较，**P<0.01；与模型组比较，△P<0.05。图3 各组小鼠皮层APP、BACE1蛋白表达水平比较

3 讨论

中医学认为阿尔茨海默病属于“痴呆”“善忘”范畴，由髓海失养、痰邪瘀阻引起的神志疾病，其病在脑，以表情淡漠、沉默少言，甚者终日不语、行为失常为主要临床表现。《本草纲目·辛夷·发明》云：“脑为元神之府”。《甲乙经·卷二》曰：“督脉者，起于下极之俞，并于脊里，上至风府，入属于脑，上巅循额至鼻柱，阳脉之海也”。因此督脉的主干与分支均与脑联系密切，故素有“病变在脑，首取督脉”之说。“通督启神”法取“百会”“印堂”“人中”3穴，发挥通经活络、醒神开窍之功[7]，延缓记忆衰老过程。为此本次研究采用“通督启神”电针，并采用自制鼠套固定小鼠，可以减少小鼠在电针治疗时产生的应激反应，降低应激反应对蛋白表达的影响，以便观察电针干预对痴呆小鼠的治疗作用。

APP/PS1双转基因小鼠模拟AD的病理过程，是一种广泛用于AD研究的可靠动物模型。研究表明，该动物模型会损害淀粉样蛋白加工过程，导致Aβ1-42沉积增加[8]，加速溶酶体蛋白水解和轴突缺陷，脑区功能连接减少[9]。APP/PS1小鼠在痴呆后期，主要病理表现为脑萎缩[10]、脑葡萄糖代谢减少以及明显的空间记忆学习障碍[11]。以往报道指出，5月龄双转基因小鼠Morris水迷宫逃避潜伏期与对照组无明显差异，7～8月龄的APP/PS1双转基因小鼠脑区开始出现广泛的Aβ病理表现、神经纤维营养不良、星形胶质细胞和小胶质细胞损伤以及学习记忆行为障碍[12-14]，提示7月龄APP/PS1痴呆小鼠模型空间学习记忆受损，适用于本次实验研究。

Aβ级联学是当今比较公认的阿尔茨海默病发病机制学说，此学说认为Aβ的神经毒性和沉积是AD发病的重要事件。当Aβ含量升高时，并不能被细胞完全代谢掉，反而会在细胞中大量沉积，导致Aβ老年斑形成，促使神经原纤维缠结或神经元死亡的病理过程。Aβ可能通过影响参与细胞内吞过程的蛋白分子的正常功能，从而导致突触囊泡循环和神经递质释放的异常，引发记忆力减退及认知功能障碍等症状。实验研究表明，APP/PS1痴呆小鼠皮层Aβ清除能力减弱，不能被内皮细胞向外周转移或被周细胞吞噬，Aβ表达增加，小鼠学习认知能力下降[15-17]。APP加工及代谢的关键酶包括α、β、γ-分泌酶。在AD的发病过程中，α-分泌酶途径受到抑制，β-分泌酶成为APP主导代谢途径，β-分泌酶通过异常切割APP，产生可溶性APP-β片段和膜结合型的C-99片段，后经γ-分泌酶作用于C-99片段以产生Aβ的C端。研究发现在AD患者脑中β-分泌酶的表达显著增加[18-19]，并明显加速AD相关病理表现。BACE1又称Ⅰ型跨膜天冬氨酸蛋白酶，是β-分泌酶在脑内的主要表现形式，通过异常切割APP，主要产生3种氨基酸大小的Aβ，而其中Aβ1-42氨基酸片段较长，较其他形式的Aβ具有更高的自聚性，其神经毒性也更高[20]。BACE1主要在神经元轴突中运输，并积累在AD中淀粉样蛋白沉积附近的营养不良性神经突起[21]。研究表明，敲除BACE1基因小鼠的β-分泌酶活性丧失，其组织形态、脑组织化学、神经肌肉效应与野生型同窝小鼠并无明显差异[22]，为BACE1作为AD治疗靶点提供了依据。

相关研究表明，SP600125可以通过特异性的抑制JNK信号通路，降低APP/PS1痴呆小鼠大脑皮层p-APP(Thr668)的含量，降低APP/PS1小鼠皮层组织中BACE1的表达，促进APP非淀粉蛋白样途径并抑制其淀粉蛋白途径代谢过程，使可溶性APP-β片段减少，从而抑制脑内Aβ1-42的表达，减少Aβ1-42诱导的细胞凋亡反应，可有效改善痴呆等退行性疾病的学习记忆障碍[23-24]。本次研究通过对比观察SP600125和电针干预的作用，检测其靶点蛋白BACE1 和APP 的表达含量，进一步佐证督脉电针对AD的治疗作用。

本实验HE染色显示，电针组和药物组核固缩现象较模型组改善，但电针组细胞排列较为整齐，提示电针和药物均可减少神经细胞损伤现象，促进神经细胞的再生和重新排列，但电针治疗效果优于阻断剂SP600125。Western blot结果显示，与模型组比较，电针组和药物组APP、BACE1的表达均减少，而药物组APP表达差异无统计学意义，提示督脉电针和药物均可有效减少APP、BACE1蛋白表达，但电针的有效性明显优于SP600125。电针抗痴呆的作用机制复杂多样，可能通过减少BACE1的表达、下调APP的异常切割、抑制Aβ的过度生成以起到保护神经元的作用。另有相关研究提出，BACE1不仅通过异常切割APP使Aβ沉积增加，同时通过参与其他引发记忆力减退的细胞过程来抑制小鼠记忆形成，即使在Aβ神经毒性不存在的情况下[25]，此还需进一步实验证实。