用gap基因和MALDI-TOF MS技术对临床常见凝固酶阴性葡萄球菌快速分子鉴定

翟 鑫，冯柏娥，张雪静，刘朝军

凝固酶阴性葡萄球菌(coagulasenegativestaphylococcus，CNS)属于革兰阳性葡萄球菌，通常被认为人体正常菌群，但随着广谱抗生素广泛使用，各种插管和支架患者的增多,化疗、放疗、激素和免疫抑制剂的大量使用，以及恶性肿瘤治疗等因素导致机体免疫功能下降，临床感染率逐渐增高，已经成为临床院内感染最重要的潜在病原菌[1]。

目前对于CNS的鉴定，主要通过表型鉴定，通过分析病原菌的生化反应特性区分，如VITEK2 GP和BD试剂盒，对于一些不典型菌株和少见菌株，该系统往往无法加以准确区分[2]。而一些基于PCR扩增的分子学方法已得到广泛应用，目前微生物分子鉴定主要通过16S rDNA基因方法，研究显示这些基因方法要明显优于表型方法[3]，但在区分CNS具体种属上，GenBank基因库比对往往会出现基因相似率过高的情况。有研究表明gap基因能够准确的鉴定CNS,gap基因是一种编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的转录蛋白，存在于葡萄球菌细胞壁中，可以用于CNS的快速分子鉴定[4]。本研究收集临床常见CNS，采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)蛋白质质谱鉴定方法进行鉴定，并与gap基因鉴定进行比较，以便建立对CNS的快速分子鉴定，为临床提供快速和准确诊断。

1 材料与方法

1.1 菌种来源 收集中国人民解放军总医院第六医学中心2016年1月—2017年12月临床分离的CNS,分别为腐生葡萄球菌、路邓葡萄球菌、人葡萄球菌、人葡萄球菌人亚种、产色葡萄球菌、头状葡萄球菌、鸡葡萄球菌、溶血葡萄球菌、木糖葡萄球菌、科氏葡萄球菌解脲亚种、沃氏葡萄球菌、中间葡萄球菌、解糖葡萄球菌、缓慢葡萄球菌和松鼠葡萄球菌。标准菌株为表皮葡萄球菌ATCC12228，实验菌株经过表型方法API20 Staph和VITEK2 GP确认鉴定。

1.2 DNA提取 采用煮沸裂解法，提取目的DNA[4]。

1.3 PCR扩增 Gap基因上游序列5′-ATGGTTTTGGTAGAATTGGTCGTTTA-3′，下游序列5′-GACATTTCGTTATCATACCAAGCTG-3′，扩增片段大小931 bp[5]。反应体系50 μL：10×Buffer(包含MgCl2)5.0 μL,dNTPS(2.5 mol/L)4 μL，Primer(10 μmol/L混合)2 μL，Tag酶0.25 μL(日本TaKaRa公司)，双蒸水30 μL，DNA模板8 μL。扩增条件：94 ℃加热2 min后，40个循环：95 ℃ 20 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 40 s,72 ℃延伸5 min，扩增产物通过凝胶电泳获取目的条带，留取扩增产物进行测序。

1.4 生物信息分析 获得的gap基因原始序列，在GenBank数据库上传比对，分别进行多序列比对分析和进化树同源分析，最终结果采用自举检验(Bootstraping)进行可信度统计分析。

1.5 MALDI-TOF MS蛋白质质谱鉴定 蛋白质质谱鉴定采用VITEK MS全自动快速微生物质谱检测系统(法国生物梅里埃公司)，严格按照操作手册进行操作获取质量图谱，并通过VITEK MS数据库进行分析，从而获得鉴定结果，定标菌株为大肠埃希菌ATCC8739。

1.6 统计学处理 采用ClustalX进行多序列比对，进化树分析采用MEGA4.O软件，统计分析采用自举检验(Bootstraping)和UPGMA法。

2 结 果

2.1 gap基因序列分析 Gap基因扩增获得目的条带，纯化后进行序列测定，获得序列在GenBank中进行Blast比对。序列矩阵分析显示各种细菌序列比对有较大差异(39%～98%)，未出现序列比对大于99%相似率，gap基因分析能完全区分CNS，表1。

表1 16种CNS gap基因矩阵比对分析

2.2 基因进化树同源分析 Gap基因矩阵分析显示有足够序列差异，同时采用UPGMA算法构建CNS进化树，同源分析显示除路邓葡萄球菌和溶血葡萄球菌可信度较低外(77%)，其他菌种统计可信度分析都在90%以上，进化树统计算法都比较可信，相近菌种两两比较可信度分析甚至达到98%以上，图1。

2.3 MALDI-TOF MS蛋白质质谱鉴定 16种CNS得出清晰的蛋白质质谱图，如表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌MALDI-TOF MS蛋白质质谱图(图2)。与梅利埃已有数据库进行比对发现，每种细菌鉴定率都大于99%以上，与gap基因鉴定的细菌种类完全符合(符合率100%)。

图1 gap基因UPGMA法系统发育树状图

图2 表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌MALDI-TOF MS蛋白质质谱图

3 讨论

CNS致临床感染病例日益增多，受到临床重视，实验室对CNS的鉴定主要通过表型的方法，但有些临床菌株不能被准确鉴定到种，需要通过分子学的方法。目前细菌鉴定常采用16S rRNA基因方法[6-7]，但文献研究显示，由于葡萄球菌16S rRNA序列几乎完全相同，不能用于葡萄球菌菌属的分类鉴定[8]；而研究显示gap基因能够对葡萄球菌菌属进行区分，特别是对相近的CNS进行准确鉴定[4，9]。本研究对gap基因序列分析显示，16种CNS序列相似率为39%～98%，相似率最高人葡萄球菌和人葡萄球菌亚种(98%)，低于文献常见报道的99%判断标准[10-11],有足够序列差异区分CNS；而gap基因序列同源分析显示，16种CNS分析具有较高的可信度(大于77%)，因此通过gap基因序列分析，能够对CNS种类进行准确鉴定。

近年来，随着科技的发展，越来越多的诊断技术应用到细菌的鉴定，MALDI-TOF MS蛋白质质谱技术就是其中之一。MALDI-TOF MS蛋白质质谱技术在蛋白质水平上对细菌进行鉴定，与表型和分子鉴定相比，VITEK MS的MALDI-TOF MS蛋白质质谱技术具有如下特点：①自动化、快速和高通量，平均每分钟完成1～2个菌株鉴定；②成本低廉，鉴定耗材成本低于传统鉴定板条；③鉴定范围涵盖广，可以对临床常见病原菌进行准确鉴定。目前已有文献对MALDI-TOF MS蛋白质质谱技术在微生物鉴定中应用进行研究，该方法已经逐步应用于临床，要明显优于传统表型鉴定，在CNS鉴定过程中，具有快速、准确和价廉等特点[12-16]，我们在对16种CNS分子鉴定的基础上，分别对CNS进行MALDI-TOF MS蛋白质质谱分析，发现该方法与gap基因鉴定方法具有100%的符合率，说明MALDI-TOF MS蛋白质质谱技术在CNS鉴定中，比传统方法和分子方法具有优势，可以用于CNS的快速和准确鉴定。