一例鸡源金黄色葡萄球菌的分离鉴定与耐药性分析

赵鹤庭，严红亚，何辉，罗文华，字吉祥，常志顺*，信爱国*

(1.云南省畜牧兽医科学院 养禽与禽病研究所,云南 昆明 650224；2.洱源县动物疫病预防控制中心,云南 洱源 671200； 3.蒙自市文澜镇畜牧兽医站，云南 蒙自 661100； 4.云南农业大学动物医学院，云南 昆明 650201)

金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus, SA)是一种常见的需氧或兼性厌氧革兰氏阳性条件性病原菌，广泛存在于环境中、健康动物及家禽的皮肤和羽毛上。鸡感染金黄色葡萄球菌临床大多表现出化脓性关节炎、皮炎、骨膜炎等特征，有些鸡群感染后临床特征不明显。近年来，禽葡萄球菌病的发生有上升的趋势[1、2]。 流行病学调查显示，金黄色葡萄球菌能够感染从鸡胚到成年鸡各个阶段的鸡群，造成鸡关节炎、瘫痪甚至死亡[3]。 在雨季和潮湿季节发病较多，尤以8—11月为高发期，发病率与死亡率因鸡群的饲养管理状况、环境条件及治疗措施是否得当而有较大差异[4、5]。本文对2019 年2月送检的临床疑似葡萄球菌感染的蛋鸡通过临床症状和病理剖检，采集组织样品进行细菌分离鉴定，确诊为致病性金黄色葡萄球菌感染。

1 材料与方法

1.1 样品来源

2019年2月，云南某养鸡场送检蛋鸡，发病鸡群主要表现为产蛋率下降，食欲减退至废绝，跛行。通过解剖、采集样品进行细菌分离鉴定。

1.2 主要试剂

细菌总DNA提取试剂盒、DNA marker DL2000购自天根生物科技(北京)有限公司； 2×EasyPfu PCR SuperMix试剂购自北京全式金生物技术有限公司。普通营养琼脂和血琼脂培养基等按常规法制备；抗生素药敏纸片、革兰氏染液、细菌微量生化反应管购自(杭州)天和微生物试剂有限公司。

1.3 细菌分离鉴定

病死鸡解剖后，接种环无菌采集肝脏、骨髓等病变器官涂布于血琼脂和普通营养琼脂平板，37℃恒温培养16～24h后，挑取单菌落进行革兰氏染色，镜检，观察细菌形态。对分离菌株进行单菌落划线培养纯化后，对分离菌株进行生理生化鉴定[6]。

1.4 分离菌的PCR鉴定

按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书，提取分离菌基因组DNA。根据细菌16S rDNA 鉴定菌株的标准操作规程，将细菌16S rDNA分成3段首尾重叠片段进行扩增，片段1(引物对16S-27F /16S-519R)预计扩增片段500bp，片段2(引物对16S-357F /16S-1115R)预计扩增片段750bp，片段3(引物对16S-926F /16S-1492R)预计扩增片段560 bp。根据金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因nuc合成引物 nucF/nucR[7]，预计扩增 478bp 片段。引物序列见表 1，由昆明硕擎生物有限公司合成。 PCR反应体系为25μL，反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃时退火30s，72℃延伸45s，35个循环；最后72℃延伸7min；4℃保存。取5μL扩增产物，琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像分析仪观察结果。16S rDNA的3个扩增片段送测序，采用Vecter NTI 软件拼接，得到大约1500bp的细菌16S rDNA序列。将序列提交GenBank进行Blast比对，确定细菌的种属分类。

表1 PCR 扩增引物序列信息表

2 结果

2.1 剖检变化

胸、腿部皮下出血；关节肿胀，按压有波动感，关节囊内有浆液性渗出物(图1)；部分病禽股骨头坏死(图2)。

图1 关节炎性渗出

图2 股骨头坏死

2.2 分离菌形态特征及生化试验结果

通过细菌分离及单菌落纯化，得到的细菌在普通琼脂平板上形成表面光滑、湿润、隆起的卵圆形菌落，初期呈灰白色，继而菌落逐渐变为金黄色(图3)。菌株在血琼脂平板上形成较大菌落，在菌落周围产生明显的β溶血(图4)。革兰氏染色呈现蓝紫色，无芽孢、葡萄状菌落(图5)。分离菌发酵葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、丙酮酸，产酸；凝固酶、耐热核酸酶、透明质酸酶阳性；分离菌符合葡萄球菌属的生化培养特征，初步判断为金黄色葡萄球菌。

图3 分离菌在普通琼脂平板上的形态

图 4 分离菌在血琼脂平板上形成β溶血

图5 分离细菌革兰氏染色结果

2.3 分离菌株PCR检测及16S rDNA扩增结果

提取分离菌株基因组DNA，用引物对nucF/nucR检测金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因，结果获得预期478bp片段，对照沙门菌和大肠杆菌未见扩增产物(图6)。分离菌16S rDNA分3段扩增，分别获得预期的500bp、750bp和560bp 扩增产物(图7)，PCR产物凝胶纯化后，进行双向测序。

M：分子量标准DL2000；1：金黄色葡萄球菌nuc基因检测结果；2：禽沙门菌对照；3：大肠杆菌对照

图6金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因检测结果

M：分子量标准DL2000；1-3：分离菌16S rDNA片段1、2和片段3扩增产物

图7分离菌16Sr DNA 3个片段的PCR扩增结果

2.4 分离菌16S rDNA序列比对鉴定与分类结果

利用Vector NTI 软件将上述3个片段核酸序列拼接，获得分离菌株16S rDNA核酸序列1495bp。将分离菌16S rDNA核酸序列提交GenBank数据库进行Blast比对分析，结果显示分离菌株属于金黄色葡萄球菌。

2.5 药物敏感性试验结果

对17种药物的敏感性试验结果显示，分离菌株对头孢氨苄、恩诺沙星、妥布霉素、头孢他啶、庆大霉素、左氟沙星和卡那霉素敏感，对环丙沙星、新霉素和阿米卡星等3种药物中度敏感，对阿莫西林、四环素、青霉素G、氯霉素、复方新诺明和氨苄西林具有耐药性(见表2)。

表2 药敏试验结果

注：S：敏感；R：耐药；I：中度敏感

3 讨论

金黄色葡萄球菌感染是导致人及多种动物皮肤与软组织感染、坏死性肺炎、败血性关节炎、血管内感染、心内膜炎的病原之一[8]，是一种重要的人畜共患性病原菌。主要导致感染家禽“跛足病”、脐炎等临床症状，对养禽业危害严重。本研究从云南蛋鸡中分离出金黄色葡萄球菌，提示该菌在产蛋鸡群中存在，科学防治金黄色葡萄球菌感染对保障动物源性食品安全具有重要的兽医公共卫生意义。

对鸡葡萄球菌病的诊断，根据临床病理剖检和镜检到葡萄串状的球菌不足以确诊，需要通过细菌分离、生化试验及PCR等进行确诊。本研究测定了分离菌的16S rDNA核酸序列，进行比对确定分离菌的种属分类。16S rDNA序列具有细菌属、种的特征，作为新的分子分类技术方法，已成为细菌分类和鉴定的新方法。此外，由于葡萄球菌容易产生耐药性，临床上金黄色葡萄球菌多重耐药菌株大量出现。 本次分离菌株对阿莫西林、四环素、青霉素、氯霉素、复方新诺明和氨苄西林具有明显耐药性，分离结果对该病防治具有重要的临床指导意义。

金黄色葡萄球菌大量存在于自然环境中，特别是禽舍粪便中的金黄色葡萄球菌可产生气溶胶，通过禽舍间的通风装置互相传播，对周围空气造成污染[9]。因此，养殖场应加强饲养管理，严格执行生物安全防控措施，做好养殖场的清洁卫生和消毒工作，尽量减少各种应激因素；一旦发现鸡群有外伤时，要及时进行处理，减少疾病传播；严格淘汰感染动物等综合技术手段。国内有报道在20～25日龄接种禽葡萄球菌油乳剂苗和氢氧化铝菌苗进行免疫预防[8]，对云南蛋鸡场防控禽葡萄球菌感染具有借鉴意义。