脂质组成对人胶质瘤细胞系恶性程度的影响

齐 飚， 杨 晨， 吴 剑， 王红章， 高 竑， 李秋平,2*

1. 复旦大学附属中山医院厦门医院神经外科，厦门 361015 2. 复旦大学附属中山医院神经外科，上海 200032

神经胶质瘤是最常见的原发性颅内恶性肿瘤，约占成人原发性颅脑肿瘤的40%～50%。神经胶质瘤具有浸润性生长、易复发等特点，患者治愈率低、预后差、总体生存期短[1-2]。临床上对于神经胶质瘤恶性程度的判断主要依靠世界卫生组织(WHO)的分类系统，胶质瘤被分成4级：Ⅰ级以毛细胞型星形细胞瘤为代表，Ⅱ级以少突胶质细胞瘤为代表，Ⅲ级以间变型胶质细胞瘤为代表，Ⅳ级则为多形性胶质母细胞瘤(GBM)[3-4]。恶性胶质瘤通常指GBM，占神经胶质瘤总数的60%～70%，目前以手术为主、放化疗为辅的综合治疗疗效欠佳，GBM患者的中位生存期仅为首次诊断后的12～15个月，是目前最难治疗的癌症之一[5]。

脂质组学(lipidomics)着眼于全面系统地分析生命体脂质组成，寻找疾病相关的脂质标志物，预测脂质与生物化合物相互作用过程中的改变，进而研究脂质代谢网络和动态调控在各种生命现象中的作用规律[6]。完整的脂质组学流程包括脂质提取、脂质组鉴定和定量分析、统计学分析和数据解释，其中灵敏、可靠的脂质组分析方法是研究的难点和关键[7]。本研究拟建立并优化Shotgun脂质组学策略，对胶质瘤细胞系A172、U251和U87MG进行规模性、整体性的脂质组成鉴定，结合多变量统计分析手段，寻找与胶质瘤恶性分化演变相关的脂质变化和代谢调控网络。

1 材料与方法

1.1 细胞与主要试剂 人胶质瘤细胞系：3种成瘤能力不同的人胶质瘤细胞系，A172在裸鼠体内无法成瘤；U251具有裸鼠皮下成瘤能力；U87MG是高侵袭性胶质瘤细胞系，在裸鼠皮下成瘤最快[8]。主要试剂：色谱级甲醇、氯仿、异丙醇、正己烷购自Merck Millipore(USA)，色谱级甲酸、乙酸铵购自ThermoFisher(USA)，脂质内标购自Avanti Polar Lipids(USA)，磷酸、氯化钾购自国药集团(中国)。

2 结 果

表1 Shotgun脂质组学ESI-MS扫描方法

PC：phosphatidylcholine，磷脂酰胆碱；PE：phosphatidylethanolamine，磷脂酰乙醇胺；PG：phosphatidylglycerol，磷脂酰甘油；PS：phosphatidylserine，磷脂酰丝氨酸；PA：phosphatidic acid，磷脂酸；PI：phosphatidylinositol，磷脂酰肌醇；SL：sulfatide，硫脂；SP：sphingolipids，鞘脂；SM：sphingomyelin，鞘磷脂

图1 Shotgun脂质组学技术分析3种人胶质瘤细胞系的主要脂质组成

2.2 定量比较人胶质瘤细胞系脂质种类和脂肪酸侧链分布 通过对3个胶质瘤细胞系在正负离子扫描模式下EMS图谱进行比对，发现胶质瘤细胞系的脂质组成相似。为了获悉脂质组成与胶质瘤细胞系转移潜能的相关性，本研究对主要的脂质种类和脂肪酸侧链分布进行了相对定量分析。与无成瘤能力的A172细胞系相比，大多数甘油磷脂的种类(如PC、PA和PG)在恶性胶质母细胞瘤细胞U251和U87MG中呈现表达上调的趋势，其中PC和PA的表达升高有显著的统计学差异(P<0.05)；含d18∶1的鞘脂(d18∶1 SP)则随着胶质瘤成瘤能力和转移潜能的增加表达呈显著降低(P<0.05，图2A)。在ESI正离子扫描模式下，三酰甘油(TG)在U251和U87MG中表达上调近1.5倍(P<0.05，图2B)。

图2 人胶质瘤细胞系中主要脂质种类的相对质谱强度

通过对串级质谱PI和NL扫描的数据进行定量分析，获悉脂肪酸侧链在胶质瘤细胞系中的总体分布情况。C16、C18和C20系列的脂肪酸链是细胞系脂质组成主要的酰基侧链类型。与A172相比，C15∶0的表达在恶性胶质母细胞瘤细胞U251和U87MG中发生显著性下调；C20∶1和C20∶4的表达发生显著性上调(P<0.05)。C18∶1的表达在U251和U87MG细胞系中呈现下调趋势，C18∶3的表达则随着胶质瘤细胞系转移潜能的增加而上调，但组间差异不存在统计学意义。此外，与U251相比，C16∶0的表达在具有高转移潜能U87MG中发生显著性下调，C16∶0表达则下调约2.52倍(P<0.05，图3)。

图3 人胶质瘤细胞系中脂肪酸链分布的相对质谱强度

2.3 分层聚类分析人胶质瘤细胞系脂质变化 对3个人胶质瘤细胞系中鉴定到的所有脂质进行相对定量分析，设置卡值标准为不同组间脂质分子质谱信号强度倍数变化>1.5或<0.67且P<0.05，筛选到121个差异具有统计学意义变化的脂质分子。差异脂质分子信号强度归一化前后数据分布如图4A所示。A172、U251和U87MG的变量组间差异采用单因素方差分析检验(ANOVA)来排序，分层聚类分析(HCA)如图4B中热图所示，Pearson相关性用于组间距离测量，每行代表1个差异表达的脂质分子，每列代表1个细胞样品，每组样品含3次生物学重复；不同色块提示从2～-2不同的组间相关值，橙色为正相关，蓝色为负相关，灰色提示缺失值。121个差异脂质分子的相对强度揭示数据分为两簇，一簇仅含A172细胞系，另一簇则包含U87MG、U251。

图4 分层聚类分析不同人胶质瘤细胞系中的差异脂质分子

2.4 多变量统计分析人胶质瘤细胞系脂质变化 主成分分析(PCA)用于对不同细胞系间的脂质变化做多变量统计学分析。在PCA分析中(图5A)，第一主成分(PC1)的方差贡献可占总方差的47.9%，并且将无成瘤能力的A172与具有成瘤和转移潜能的U251和U87MG细胞区分开来；第二主成分(PC2)的方差贡献占25.6%。变量投影重要性(VIP)准则用于差异脂质分子在解释不成瘤和成瘤胶质瘤细胞分离效果时作用的重要性，认为VIP值大于1的差异脂质分子在解释分离效果时即有重要的作用。VIP值打分最高的15个差异脂质分子见图5B，其中PC 18∶1/18∶1的VIP值高达1.63，在解释分离效果时有最重要的作用。不同的统计分析方法均表明差异脂质组成能将具有成瘤和转移能力的细胞系U251和U87MG与无成瘤能力的细胞系A172系区分开来。

图5 多变量统计学分析用于系统性分析不同人胶质瘤细胞系中的差异脂质分子

3 讨 论

脂质是三大营养物质之一，是生物膜的重要成分，是生物体储能的主要场所。脂质也是重要的信号分子，多种脂质分子及其代谢中间产物参与血管炎症、细胞增殖、细胞黏附和运动等生理和病理过程[14]。脂质是目前在化学结构上最多样化的生物有机分子，脂肪酸的长度、饱和度、双键位置以及顺反异构均影响脂质分子的空间结构，从而影响细胞膜的功能和膜蛋白的活性[15]。基于质谱分析的脂质组学技术灵敏度高，分辨率好，能进行高通量检测，并能获取脂质分子的结构信息。

脂质代谢发生改变是肿瘤细胞的重要特征之一，其与肿瘤的发生发展互为因果关系[16-17]。近年研究提示，具有生物活性的特征性脂质分子和脂质代谢通路的激活与多种实体肿瘤的进程紧密相关。Yue等[18]在晚期和转移性前列腺癌组织单细胞水平的脂滴中发现异常积累的酯化胆固醇，这导致抑癌基因PTEN失活和促进肿瘤生长的代谢途径激活。Guri等[19]发现蛋白mTORC2能够刺激肝脏肿瘤中神经酰胺和心磷脂的产生，从而满足癌细胞对营养代谢和能量的需求。此外，结构多样的脂质能与蛋白质发生相互作用。鉴于每种细胞类型中含有数千种不同结构的脂质分子，生命体很可能存在大量的蛋白质-脂质相互作用，构成复杂的代谢调控网络[20]。综上，代谢物能驱动异常的基因调控，代谢重编程对基因表达、细胞增殖与肿瘤微环境影响深远。

肿瘤细胞的高侵袭性与频繁复发相关，细胞系在裸鼠体内的成瘤能力在一定程度上反映了恶性潜能。虽然A172、U251和U87MG来源于不同的患者，但不同的生长模式和体内成瘤能力使其成为研究胶质瘤发生发展的有价值的细胞模型。脂质分子在肿瘤生长中极为重要，并且可能与胶质瘤复发转移有关。脂质表达谱的比较研究可以揭示差异功能脂质并提供有用的信息。由于分辨率高、快速灵敏、重现性好以及高通量等优点，Shotgun技术常用于系统研究生命体的整体脂质组成及其复杂的代谢网络[21]。本研究通过Shotgun脂质组学分析，共鉴定到1 541种脂质分子，筛选到121个具有统计学差异变化的脂质分子，并通过多元变量统计分析揭示差异脂质组成能将具有成瘤和转移能力的细胞系U251和U87MG与无成瘤能力的细胞系A172系区分开来。这些差异表达的脂质可能与神经胶质瘤转移复发有关。这些发现可能有助于开发新的诊断标志物和胶质瘤的治疗靶点。

目前报道的神经胶质瘤相关的脂质组学研究，主要将神经胶质瘤细胞系或临床血清/血浆样本作为研究对象[22-23]。科学界尚未系统绘制与神经胶质瘤各组织学分级密切相关的脂质组成图谱，特别是针对组织学分级为Ⅳ级的恶性胶质母细胞瘤临床标本的脂质组学研究尚未见报道。我们正在积极收集神经胶质瘤组织标本，通过对神经胶质瘤组织标本进行大规模脂质定性定量研究，挖掘神经胶质瘤是否有特定的脂质代谢特征；筛选不同组织学分级的癌组织中显著变化的脂质分子，以确定差异功能脂质在人类胶质瘤进程中的特异性和预后价值。综上，我们试图在不久的将来，实现在脂质层面上对神经胶质瘤转移复发进行预测，并结合随访资料探讨脂质组成差异对神经胶质瘤发生、发展以及预后的影响。