PCSK9对急性胰腺炎局部并发症及不良预后事件的预测价值

李正良， 蔡 瑜， 张顺财

复旦大学附属中山医院消化科，上海 200032

急性胰腺炎是由于多种病因导致胰酶在胰腺内被激活，引起胰腺自身消化的疾病；轻者为胰腺水肿，重者出现胰腺出血甚至坏死；急性胰腺炎起病急骤，会引起全身炎症反应综合征，若出现局部和全身并发症，则导致预后不良[1]。近年来，胰腺炎发病率呈逐渐升高的趋势[2-3]；针对急性胰腺炎，目前临床使用多种评分体系，如Ranson和APACHE Ⅱ评分系统；但在实际应用中，这些量表均存在缺陷[4]。因此，有必要针对胰腺炎的早期诊断、患者分层以及新疾病预后指标进行进一步研究。

无论何种病因引起的急性胰腺炎，均存在内毒素血症[5-6]。一是胆道中细菌毒素逆行入血；二是急性胰腺炎所致有效血容量不足和内脏器官灌注不良，出现肠道上皮灌注不足，导致肠上皮细胞缺血缺氧，肠道屏障功能减弱，肠壁通透性增加，肠道细菌入血；伴随着肠蠕动动力减弱/消失，腹腔组织间隙渗出增加可能导致腹腔内高压，进一步造成肠道菌群转位及内毒素血症的发生。内毒素可与免疫细胞表面的模式识别受体结合，释放大量炎症因子，加剧全身炎症反应，导致急性胰腺炎局部并发症和预后不良[7-8]。

前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶Kexin 9型(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9, PCSK9)主要由肝细胞产生，既往认为主要调节脂代谢。PCSK9通过与低密度脂蛋白受体(low-density lipoprotein receptor, LDLR)结合，促进LDLR内吞和溶酶体途径降解，引起高脂血症[9]。但最近的研究[10]发现，PCSK9除了血脂水平的调控外，细菌、病毒或寄生虫感染均可诱导其表达，促炎症因子(LPS、TNF-α、ox-LDL)亦可促进PCSK9的合成和分泌。Walley等[14]报道了PCSK9在炎症反应中可能的作用；Dwivedi等[12]认为PCSK9可作为LPS诱发腹膜炎大鼠模型的炎症标志，且使用PCSK9抗体处理可提高大鼠的生存率，为腹膜炎大鼠提供了保护作用。既往研究[13]也表明姜黄素可通过抑制PCSK9表达，改善大鼠肝硬化所致肠源性内毒素血症。但是，将PCSK9作为治疗靶点能否在脓毒血症中提供保护作用仍存在争议[14-15]。

鉴于急性胰腺炎中存在肠道菌群转位及内毒素血症的现象[16]，以及LPS可促进PCSK9合成的特点，本研究拟检测急性胰腺炎患者血清中PCSK9的浓度，随访PCSK9变化，并对PCSK9与患者疾病严重程度的相关性进行研究，以期明确PCSK9作为急性胰腺炎局部并发症的预测价值以及PCSK9作为AP预后评价指标之一的可行性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2018年5月至2018年8月复旦大学附属中山医院收治的急性胰腺炎患者46例，其中男性26例，女性20例，年龄29～88岁，平均(59±16.26)岁。入选标准：符合急性胰腺炎的诊断标准；患者20～90岁；既往无胰腺炎病史，本次为初发初诊胰腺炎。排除标准：伴发肝脏占位或其他恶性肿瘤个人史；患者入院后24 h内签字出院；妊娠妇女；免疫抑制疾病；近1个月内的感染性疾病病史；合并严重肝肾功能不全。另从同期我院拟行胃部ESD术的消化科住院患者中(病理证实非恶性肿瘤)随机抽取40例作为阴性正常对照组。对照组患者无系统性疾病、恶性肿瘤史、急性及慢性感染，且在研究进行时无其他用药。本研究通过复旦大学附属中山医院伦理委员会批准(Y2016-156)。所有研究对象知情同意且签署知情同意书。

1.2 急性胰腺炎的诊断标准 根据2012亚特兰大急性胰腺炎分类标准，患者病情分级：轻度、中度、重度。急性胰腺炎的局部并发症定义为急性胰周积液、胰腺假性囊肿、急性坏死性积聚和包裹性坏死，按照患者影像学资料整理。患者病因分类定义为胆源性、高三酰甘油血症、酒精性及其他。根据修订版Marshall评分系统，呼吸、心血管或肾脏系统中任一系统得分≥2分即可诊断为器官衰竭。

1.3 影像学评估 通过本院电子医疗系统搜集入院急诊当时CT及后续随访CT影像学资料及报告，CT局部并发症的标准依照CT severity score(The Balthazar Score)的CT影像学分级定义。

1.4 预后不良事件定义 患者收治入重症监护室ICU治疗，安置小肠营养管或肠外营养，住院天数≥15 d，死亡，发生任意器官衰竭(根据Marshall评分定义)。其中，同时发生多个事件的患者也定义为预后不良。

1.5 循环中PCSK 9水平测定 患者入院当日完善诊断后，经肘静脉抽取静脉血2 mL，置于含EDTA的试管中，1 200×g离心10 min，取血清，-80℃冰箱保存于复旦大学附属中山医院中心实验室。采用酶联免疫吸附试验(ELISA法)测定血清中的PCSK9水平。ELISA实验操作严格按照艾博抗公司经销的ab209884-Human PCSK9 Simple Step ELISA Kit说明书进行。同期搜集患者及对照组入院当日血检资料。

2 结 果

2.1 各组患者一般资料的对比 结果(表1)表明：与对照组对比，急性胰腺炎患者(AP)各组年龄构成比(P=0.163 2)，性别比(P=0.959 5)差异无统计学意义。患者入院当天血液生化和常规检验资料(表2)表明：患者各组PCSK9水平均与对照组相比差异存在统计学意义(P=0.018 7)。

表1 AP组与对照组基本资料比较

MAP:轻度急性胰腺炎(mild acute pancreatitis);MSAP：中度急性胰腺炎(moderately severe acute pancreatitis)；SAP：重度急性胰腺炎(severe acute pancreatitis)

指 标对照组MAPMSAPSAPPCSK9 (ng/mL)30.48±5.71336.11±4.711∗39.61±2.346△△42.95±1.048▲▲C-反应蛋白 (mg/L)1.772±0.683 730.03±15.3541.08±99.1295.12±78.24降钙素原 (ng/mL)0.201 5±0.153 10.295±0.1791.524±1.0421.262±2.369白细胞计数 (×109/L)6.356±1.70412.07±2.7349.568±3.99013.69±3.729淀粉酶 (U/L)96.85±31.021 334±1 1121 515±1 359865.6±1 159脂肪酶 (U/L)25.94±13.4539.0±731.1870.6±683.9981.1±430.2白蛋白 (g/L)45.9±5.74239.78±5.01938.73±2.00541.44±3.110ALT (U/L)31.67±9.74474.44±65.16126.4±144.389.56±100.7AST (U/L)27.83±7.032103.7±113.8169.4±204.763.78±70.70TCH (mmol/L)54.2±37.66136.9±31.92141.3±36.97240.4±124.8TG (mmol/L)10.29±5.90282.75±44.03150.8±106.9566.6±758.1HDL (mmol/L)38.7±6.87645.30±22.4330.77±8.42927.76±11.60LDL (mmol/L)77.79±4.95175.20±28.3379.81±23.6593.90±30.86Lipo(α) (mg/L)144.8±96.49240.8±231.3213.0±162.665.49±60.15红细胞计数 (×1012/L)5.089±0.400 14.507±0.594.515±0.757 94.972±0.816 1血红蛋白 (g/L)153.9±14.02138.0±16.72136.2±25.15154.9±26.15红细胞比容 (%)44.64±2.90241.72±4.71641.41±7.87144.16±5.284血小板计数 (×109/L)233.5±68.09219.6±98.28223.7±102.4221.8±79.79血尿素氮 (mmol/L)5.228±1.3095.844±1.2555.555±1.2395.600±2.539血清肌酐 (mmol/L)82.51±22.7661.78±9.77076.09±20.3177.67±37.21TNF-α (pg/mL)15.76±11.208.433±2.51516.09±4.08115.59±3.260IL-2R (pg/mL)419.7±160.8442.3±158.0763.6±318.2674.7±307.4IL-6 (pg/mL)4.223±5.623115.7±139.852.42±26.0667.35±54.92IL-8 (pg/mL)10.23±13.749.333±3.21523.79±3.91427.27±12.47IL-10 (pg/mL)7.337±3.7887.067±3.5809.191±3.9658.539±3.623Na+ (mmol/L)138.6±6.797140.6±3.127140.3±1.489138.2±3.623Mg2+ (mmol/L)0.858±0.111 50.835±0.0780.795 9±0.0710.903 3±0.254 3D-二聚体 (mg/L)0.374 7±0.207 82.834±2.7074.205±2.0141.866±1.940

ALT：丙氨酸氨基转移酶；AST：门冬氨酸氨基转移酶；TCH：血总胆固醇；TG：三酰甘油；HDL：高密度脂蛋白；LDL：低密度脂蛋白；Lipo(a)：脂蛋白a；TNF-α：肿瘤坏死因子-α；IL-2R：白细胞介素-2受体；IL-6：白细胞介素-6；IL-8：白细胞介素-8；IL-10：白细胞介素-10；Na+：血清钠离子浓度；Mg2+：血清镁离子浓度. 将患者依照亚特兰大分类标准分层与正常对照组进行单因素的ordinary one-way ANOVA检验，F(3，27)=3.941，P=0.018 7，进一步的Dunnett’s multiple comparisons test多重比较结果表明，对照组与轻度(Md=-5.866，*P=0.013 9)，中度(Md=-8.757，△△P=0.003 0)和重度(Md=-10.90，▲▲P<0.000 1)胰腺炎患者差异均有统计学意义

2.2 血清PCSK9在急性胰腺炎患者组中显著升高 结果表明，急性胰腺炎患者组血清PCSK9水平[(38.51±4.043) ng/mL]高于对照组[(30.78±4.454)ng/mL]，差异具有统计学意义(P=0.000 4)。进一步分析显示：将患者依照亚特兰大分类标准分层为轻度、中度和重度急性胰腺炎，与正常对照组进行单因素ordinary one-way ANOVA检验(P=0.018 7)，进一步的多重比较结果表明，对照组与轻度(P=0.013 9)、中度(P=0.003 0)和重度(P<0.000 1)胰腺炎患者差异有统计学意义(表2)。

2.3 血清PCSK9水平是急性胰腺炎局部并发症发生的独立危险因素

2.3.1 局部并发症发生与否的单因素Logistic回归分析 以患者病程中是否发生局部并发症为因变量，进行单因素Logistic回归分析显示，PCSK9、AMY、AST、Lipo(a)、TNF-α、ALT、WBC、LDL水平是影响急性胰腺炎患者发生局部并发症与否的主要因素；性别、年龄、病因、入院时收缩压(systolic blood pressure, SBP)以及其余血检资料等因素差异无统计学意义(表3)。

表3 局部并发症单因素Logistic回归分析

2.3.2 局部并发症发生与否的多因素Logistic回归分析 进一步的多因素Logistic回归分析显示，诊断当日血清中PCSK9水平(P=0.030，OR=1.595)是影响急性胰腺炎患者病程中局部并发症发生的独立危险因素，ALT水平(P=0.037，OR=0.973)是影响急性胰腺炎患者病程中局部并发症发生的独立保护因素(表4)。

表4 局部并发症多因素Logistic回归分析

2.4 d3与d10的PCSK9水平变化差值可预测预后不良相关事件

2.4.1 预后不良相关事件的Logistic单因素回归分析 预后不良事件统计如下：收治入重症监护室ICU治疗(2例)，安置小肠营养管或肠外营养(2例)，住院天数≥15 d(14例)，死亡(1例)，发生任意器官衰竭(10例)。以患者病程中是否发生预后不良相关事件为因变量，进行单因素Logistic回归分析显示，PCSK9，诊断第3天血清与入院后第10天血清(d3与d10)PCSK9水平变化差值(ΔPCSK9)，入院当日血糖(Glucose)，C-反应蛋白(C-reactive protein, CRP)，高密度脂蛋白(high density lipoprotein, HDL)，乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)及白细胞介素-8(interleukin-8，IL-8)水平是影响急性胰腺炎患者发生预后不良事件的主要因素；性别、年龄、病因、血WBC、AMY及其余血检资料等因素差异无统计学意义(表5)。

表5 预后不良事件单因素Logistic回归分析

ΔPCSK9：诊断第3天与入院后第10天(d3与d10)患者血清PCSK9水平差值

2.4.2 预后不良相关事件的Logistic多因素回归分析 进一步的多因素Logistic回归分析显示，诊断第3天血清与入院后第10天血清(d3与d10)PCSK9水平变化差值(P=0.026，OR=0.085)是急性胰腺炎患者病程中预后不良事件发生的独立保护因素(表6)。

表6 预后不良相关事件的Logistic多因素回归分析

2.5 PCSK9水平与伴发高脂血症的相关性

2.5.1 PCSK9在d0与HDL及TG呈相关性 在d0，患者血清PCSK9与HDL及TG具有相关性，同时与TCH、LDL没有相关性(表7)。

表7 患者入院时(d0)血清PCSK9水平与脂代谢

2.5.2 PCSK9在d10与TG不再具有相关性 在d10时间节点，PCSK9只与HDL在P<0.05水平具有相关性，不再与TG呈现相关性(表8)。并且无论在d0还是d10，PCSK9均未体现出与LDL的相关性。鉴于这种相关性的从有到无，可以认为，在急性胰腺炎中的PCSK9水平的升高，至少与LDL及其受体的稳态调节并非具有明确的相关性，亦不具备因果关系的条件，并且与急性胰腺炎中TG的升高也不具备直接的相关性与因果关系。

表8 患者入院后第10天(d10)血清PCSK9水平与脂代谢

3 讨 论

急性胰腺炎是全身炎症反应，其急性过程中发生的肠道菌群转位，造成LPS入血、内毒素血症和炎症反应的加剧[16]。对于急性胰腺炎的血清标志，目前采用的AMY及LIP不足以单独评估AP的严重程度及AP并发症的发生率，并且对于AP预后的预测价值有限；目前使用的各种临床评分标准亦有其局限性，寻找新的AP血清学标志和疾病预测指标很有必要。

PCSK9是LDLR相关蛋白调控子，生理作用下与脂代谢及LPS从血液循环中的清除密切相关，其水平不仅受血脂水平的调控，还被细菌、病毒等病原体感染后产生的LPS和其他炎症因子所调控。我们以及其他学者的研究[11-14]表明将PCSK9作为目标靶点，可能对脓毒血症有保护作用。

鉴于上述理论和工作基础，我们推测PCSK9可能在急性胰腺炎发生和发展过程中产生一定的变化。本研究结果发现，PCSK9在急性胰腺炎患者中显著升高；经过分层统计分析发现，PCSK9升高在MAP、MSAP及SAP均有统计学差异；进一步Logistic回归分析显示，PCSK9升高是急性胰腺炎局部并发症发生的独立危险因素，PCSK9水平在d3与d10间下降不明显是不良预后事件发生的独立危险因素。因此，PCSK9升高水平可以作为急性胰腺炎严重程度及局部并发症的预测因素。PCSK9在患者急性胰腺炎严重程度分层方面可能具有潜在的作用，并且这种作用是独立于其他常用急性炎性标志物(如CRP、ESR)以及常用的胰腺炎血清标志物AMY、LIP的。

急性胰腺炎中引起PCSK9升高的具体分子作用机制尚不明确；正常生理状态下血清中PCSK9水平变化主要受到血脂代谢调控，然而炎症反应过程也会导致PCSK9水平的上调[10]。在急性胰腺炎中，除了内毒素血症外，患者还往往存在血脂代谢的紊乱，高三酰甘油血症和高胆固醇血症[18-19]。所以，PCSK9在急性胰腺炎中的水平变化，是受血脂代谢过程中LDLR调控的因素影响，还是和急性胰腺炎的炎症反应相关，暂未明确。本研究统计分析显示，PCSK9血清水平的升高在d0时间节点与HDL及TG具有相关性，同时与TCH、LDL没有相关性，而在d10，PCSK9血清水平不再与TG具有相关性，并且在这两个时间节点，PCSK9水平均与LDL不具备相关性，鉴于这种相关性在时间上不具备连续性，提示在急性胰腺炎中的PCSK9水平的升高，与LDL及其受体的稳态调节并不具有明确的相关性。

研究结果提示在急性胰腺炎过程中，主要是由于内毒素血症，LPS升高，刺激肝细胞合成和分泌PCSK9增加引起的。在实际中，患者因急性胰腺炎造成PCSK9水平增高，导致肝细胞表面LDLR减少，从而造成LPS从血流中清除减少[20]，进一步导致全身炎症反应的继续，在胰腺局部则表现为局部并发症的发生，在整体则表现为预后不良，整体临床病程反复。当然，内毒素相关的反应性血脂代谢紊乱，也可能是血清PCSK9反应性升高的一种潜在可能；这需要体外实验和动物模型去进一步验证。

综上所述，PCSK9可作为新的急性胰腺炎诊断的分子，对于AP局部并发症的预测以及患者整体预后的预测有一定的作用，也可作为急性胰腺炎潜在的治疗靶点，值得今后继续研究。