江苏地区1株锦鲤疱疹病毒的鉴定

袁锐 方苹 倪金俤

摘要：对我国江苏地区养殖锦鲤暴发性鲤疱疹病毒病（koiherpes virus disease，简称KHVD）的病原进行鉴定。2018年5月，江苏省一锦鲤养殖场暴发不明原因传染疾病，病鱼肝、脾、肾脏中未分离到細菌。透射电镜观察发现大量球状病毒粒子。提取自然发病鱼的鳃、肾、脾、肝组织DNA作为模板进行PCR检测，结果显示为阳性。Blast比对结果显示，扩增序列与锦鲤疮疹病毒（koi herpesvirus，简称KHV）胸苷激酶（thymidine kinase，简称TK）基因和KHV DNA聚合酶（SPH）基因核苷酸序列同源性为99%。对病毒株的TK基因全长序列进行系统发育分析，证实该毒株属于KHV亚洲型毒株。

关键词：锦鲤;锦鲤疱疹病毒;病毒鉴定;系统进化分析

中图分类号：S941.41+2   文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）12-0200-04

鲤疱疹病毒病（koiherpes virus disease，简称KHVD）是由锦鲤疱疹病毒（Koi herpesvirus，简称KHV）引起锦鲤和鲤鱼及其普通变种的一种急性、接触性传染病，该病被我国农业部列为二类动物疫病，对鲤鱼和锦鲤的养殖危害极大，致死率高达80%～100%[1～3]。其病原KHV是双链DNA病毒，基因组全长为295 kb[4]，编码164个开放阅读框，KHV有多种基因型，目前已完成全基因组测序的分离株有日本株（KHV-J）、美国株（KHV-U）、以色列株（KHV-I）以及在我国分离的KHV-GZ11，其中，KHV-U、KHV-I和KHV-GZ11的相似性较高[4-5]。目前，我国国内报道并成功分离的KHV毒株有辽宁株（KHV-cj）、广州株（KHV-GZ1301）、黑龙江株（KHV-hlj）等[6-8]。现有研究表明，KHV是一种具有高传染性、高发病率和高死亡率的病毒性疾病，可感染任何年龄的锦鲤与鲤鱼，其典型临床症状是行动迟缓、食欲不振、体表尤其是皮肤和鳍基部出现出血症状，严重者眼球凹陷、鳃苍白并伴有中度至严重的坏死，感染后7～10 d开始出现死亡[9-11]。由于KHVD流行范围广，危害大，已经引起我国及世界多个国家的高度重视[12]。

2018年5月，江苏省苏州地区一锦鲤养殖场发生大面积死亡，发病鱼体表黏液明显增多，眼球凹陷，全身体表多处出血，尤其是鳍基部严重出血，剖检后可见病鱼脾脏、肾脏明显肿大，然而从内脏器官中未能分离检测到细菌，镜检也未见寄生虫。根据病鱼的临床特征及发病时间初步判断该病由KHV引起，为进一步验证导致锦鲤大量死亡的原因，根据我国水产行业标准SC/T 7212.1—2011《鲤疱疹病毒检测方法第1部分：锦鲤疱疹病毒》设计检测引物进行病毒PCR检测，对病灶部位的电镜观察显示。根据胸苷激酶（thymidine kinase，简称TK）基因全长序列建立系统发育树，研究其株型。本研究首次报道KHV在我国华东地区暴发流行。

1 材料与方法

1.1 病样的采集

患病鱼于2018年5月采自江苏省某观赏鱼养殖场，体长50 cm左右，充氧打包运输至实验室。

1.2 主要试剂

病毒DNA提取试剂盒、脑心浸液培养基（BHI）购自北京陆桥生物技术有限公司;PCR Mix预混液购自TaKaRa公司;戊二醛等试剂均为国产分析纯。

1.3 细菌学检查

对病鱼进行解剖观察，同时在无菌操作条件下，从肝脏、脾脏、肾脏取样进行BHI平板、血平板划线分离细菌，28 ℃培养24～48 h，观察病菌生长状况，待菌落形成后进行菌落纯化和鉴定。

1.4 电镜观察

以去离子水配制2.5%的戊二醛固定液，取鳃、肾、肝、脾组织切成薄片，浸泡于戊二醛固定液中固定，在用透射电镜观察前，将组织取出切成0.5 cm×0.5 cm大小的小块，用透射电子显微镜观察并拍照。

1.5 PCR鉴定

病鱼的组织DNA提取按照病毒DNA提取试剂盒的说明进行操作。PCR检测所用引物及检测方法参照我国水产行业标准SC/T 7212.1—2011《鲤疱疹病毒检测方法第1部分：锦鲤疱疹病毒》进行。引物由TaKaRa公司合成，引物序列见表1，TK基因的扩增体系为 50 μL，反应体系包括25 μL Mix预混液，2.5 μL DNA模板，引物各0.5 μL（浓度为 100 μmol/L），21.5 μL ddH2O，扩增条件：94 ℃预变性5 min;95 ℃变性1 min，51 ℃退火 1 min，72 ℃延伸1 min，40个循环;72 ℃ 10 min，用1.5%的琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，预期得到约409 bp的PCR产物。SPH基因的扩增体系为100 μL，反应体系包括50 μL Mix预混液，5 μL DNA模板，引物各1 μL（浓度为 100 μmol/L），43 μL ddH2O，扩增条件：94 ℃ 预变性30 s;94 ℃变性30 s，63 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40个循环;72 ℃ 10 min，用1.5%的琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，预期得到约292 bp的PCR产物。将PCR产物交由生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，将测得的序列登录美国国家生物技术信息中心（NCBI）进行BLAST比对。

1.6 系统发育分析

2 结果与分析

2.1 解剖及病原检查

患病锦鲤体长约50 cm，鱼体明显缺乏活力，食欲减退，体表黏液增多，鳃丝发白（图1），病鱼鳍基部及体表出血严重（图2），解剖后发现脾脏等内脏肿大，其临床症状类似于KHV感染。制作鳃丝水浸片进行寄生虫的显微镜检查，未观察到寄生虫。

2.2 病原菌的分离

从病鱼的肝、脾、肾组织中未能分离到病原菌。

2.3 电镜观察

取病鱼的鳃、肾、脾、肝组织进行透射电镜观察，结果表明，在肾脏和脾脏组织中，可明显地观察到大量成熟或不成熟病毒粒子（圖3、图4），形状为圆形，有囊膜结构，其直径在200 nm左右，呈现出典型的疱疹病毒特征，由此证实该病毒对于鱼体的感染。

2.4 PCR鉴定

根据我国水产行业标准（SC/T 7212.1—2011）提供的PCR检测方法对发病鱼的鳃、肾、肝、脾进行KHV的TK和SPH基因特异性PCR扩增，均检测到预期大小的片段（图5），对PCR产物进行测序，经NCBI比对，序列与KHV的TK和SPH基因序列具有99%的同源性，将该毒株命名为KHV-JS。

2.5 系统发育分析

对KHV-JS样进行TK全长序列扩增，将1 000 bp左右的目的片段送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行克隆测序。结果显示，分离株的TK基因全长为997 bp，将测得序列与GenBank中登录的KHV序列进行比较，其与KHV-A1的同源性为100%。依据邻接法利用MEGA 7.0建立系统发育树，从图6可以看出，本试验中鉴定的KHV-JS株与各个亚洲株型聚在了一起，为典型KHV亚洲株型。

3 讨论

锦鲤疱疹病毒病是一种具有高传染性、高发病率和高死亡率的病毒性疾病，给我国及世界多个国家的锦鲤及鲤鱼养殖业造成严重的经济损失，被世界动物卫生组织水生动物疫病名录收录[15]。KHVD一般发病于春秋季节，高温夏季、低温冬季不发病，发病温度为18～28 ℃[16]，主要感染各个生长阶段的锦鲤和鲤鱼，相关研究表明，金鱼[12]、异育银鲫[17]等鱼类也有可能感染KHV，并可能作为病毒携带者，但是到目前为止还没有除锦鲤和鲤鱼以外的其他鱼类感染KHV导致发病的报道。鲤鱼是我国的主要淡水养殖鱼类之一，锦鲤则是我国最主要的观赏鱼养殖品种之一，一旦暴发锦鲤疱疹病毒病，高达100%的死亡率将给我国水产养殖和观赏鱼产业带来巨大的经济损失，因此，亟须开展对该病的流行病学调查和防控研究。

目前，我国已有多地流行和暴发过KHVD，主要集中在广东、东北和四川等地区，国内报道并成功分离的KHV毒株有广州株（KHV-GZ11和KHV-GZ1301）、辽宁株（KHV-cj）、黑龙江株（KHV-hlj），其中，除广州株KHV-GZ11属于欧洲株型外，其他毒株均属于亚洲株型。本研究首次报道KHVD在我国华东地区的暴发，并且成功分离鉴定了KHV-JS株。江苏省是我国淡水鱼养殖大省，全省水产养殖面积达到

63.21 hm2，其中淡水养殖总面积为43.98 hm2，水产品总产量达328.1万t，主要养殖青鱼（Mylopharyngodon piceus）、草鱼（Ctenopharyngodon idellus）、鲢鱼（Hypophthalmichthys molitrix）、鳙鱼（Aristichthys nobilis）、鲤鱼（Cyprinus carpio）、鲫鱼（Carassius auratus）等，观赏鱼养殖规模达到86 234万尾，占全国总规模的20.73%，锦鲤作为一种重要的观赏鱼类，深受消费者喜爱，具有广阔的市场前景，然而鲤疱疹病毒病的高死亡率以及具有潜伏感染的特性[18]，严重威胁着锦鲤和鲤鱼养殖业的安全。

疫苗是控制病毒性疾病最有效的途径，在一些常见的水产动物病毒病上应用广泛。减毒疫苗以及改良的活疫苗都被证明具有显著的抗病效果，但是其潜在的安全隐患仍然令人担忧，一系列不安全因素阻碍了其在生产上的应用[19]。相比传统疫苗，DNA疫苗更安全，没有毒力返强的风险，是病毒疫苗未来的发展趋势，由于不同地区KHV毒株基因型具有一定的差异性，因此对不同来源毒株进行系统发育分析以及株型鉴定，对于DNA疫苗的研制具有重要意义。Kurita等证明，来自亚洲和欧洲的隔离群有着明显的基因差异，可通过对TK基因全长序列的测定将KHV毒株区分为欧洲型和亚洲型[13]。本研究获得KHV-JS的TK基因全长序列为997 bp，经MEGA 7.0构建系统发育树，表明KHV-JS属于亚洲株型。本研究首次从我国华东地区分离鉴定1株KHV，可为KHV起源进化、分类以及疾病诊断和防控提供重要依据。

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