盐度变化对单环刺螠非特异性免疫的影响

朱晓莹 孟霄 甘宏涛

摘要：在温度为15 ℃、pH值为8条件下，测定由初始盐度2.5%变化至不同盐度（1.5%、2.0%、3.0%、3.5%）对单环刺螠非特异性免疫指标（血细胞密度、SOD和ACP活力、MDA含量）的影响。试验结果表明，盐度变化后，血细胞密度在48 h内和盐度呈显著正相关;各试验组SOD活力呈先升后降的趋势，而MDA含量表现为先降后升，且MDA含量与SOD活力呈显著负相关（r=-0.969，P<0.05）;ACP活力则呈现2种变化趋势，盐度1.5%和2.0%2组先降后升再降，盐度3.0%和3.5%2组先升后降。至处理96 h，盐度1.5%和3.5%2组的血细胞密度、SOD和ACP活力显著低于对照组，而MDA含量显著高于其他各组（P<0.05）。盐度2.0%～3.0%为单环刺螠较适宜的环境条件，盐度1.5%和3.5%条件下其免疫力显著下降，以低盐环境影响更为明显。

关键词：盐度变化;单环刺螠;非特异性免疫;血细胞

中图分类号： S917  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）12-0197-03

单环刺螠（Urechis uniconcyus）主要分布于俄罗斯、日本、朝鲜以及我国黄渤海沿岸，是我国沿海存在的唯一无管螠目物种[1]。单环刺螠肉质鲜美、营养丰富，其必需氨基酸组成符合人体的吸收比例要求，并富含二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DPA）及Fe、Zn等微量元素，提取物中还有一定的抗肿瘤和提高免疫力作用，因此具有较高的经济价值及良好的开发利用前景[2]。目前，对单环刺螠的研究主要集中于纤溶酶的分离纯化和溶栓作用提取物的分析、硫化物的应激代谢以及人工繁育等方面[3-5]，而有关环境因子对单环刺螠免疫功能影响的报道相对较少。本研究观察了不同盐度条件下单环刺螠免疫相关指标的变化，旨在探讨单环刺螠对盐度的生理调节机制，为人工养殖水环境调控提供数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料

单环刺螠体长（15.1±1.5） cm、体质量（31.2±4.2） g，于2017年4月购自江苏省连云港市水产品市场，采用循环养殖系统暂养7 d。暂养条件为：盐度2.5%，pH值=8，水温 15 ℃，自然光照，连续充气，日投喂2次藻液。选择大小相近、体表无损伤且活力强者用于试验。

1.2 试验设计

本试验初始盐度为2.5%，设对照组为2.5%，试验组分别为1.5%、2.0%、3.0%、3.5%。并采用曝气自来水和海水晶配制所需盐度的人工海水，pH值为8。每组设3个平行，每个平行随机放20条单环刺螠，于40 cm×30 cm×30 cm水族缸中饲养，水温、饵料、充气等养殖条件与暂养时相同。每天定时换水1次，每次换水50%。每个平行分别于6、12、24、48、72、96 h取3条单环刺螠，用蒸馏水冲洗，滤纸吸干体表水分，进行解剖并取其血液，保留部分全血用于测定血细胞密度，另一部分于4 ℃、12 000 r/min离心5 min，取上清液血清，于-80 ℃保存，进行测定其他免疫相关指标。

1.3 检测方法

用血球计数板计算血细胞密度，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力采用连苯三酚自氧化法测定[6]，酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）活力、丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量和样品蛋白含量参考南京建成生物工程研究所试剂盒说明进行测定。

1.4 数据分析

试验数据以“平均值±标准差”表示，采用SPSS 18.0软件进行单因子方差分析，LSD多重比较和Duncans检验，显著水平设为0.05。

2 结果与分析

2.1 盐度变化对单环刺螠血细胞密度的影响

由图1可知，处理6 h时，各组血细胞密度和盐度呈显著正相关（r2=0.955，P<0.05），以盐度1.5%组血细胞密度（1.20×108个/mL）最低，仅为盐度3.5%组的67%。处理12 h时，各试验组血细胞密度均有所上升，以盐度3.0%、3.5%组升高幅度较大，并显著高于盐度2.5%组，而盐度1.5%组血细胞密度虽有所回升，但仍显著低于其他各组（P<0.05）。随处理时间的延长，盐度1.5%、3.0%、3.5%组血细胞密度呈现下降趋势，至处理48 h时，各组血细胞密度和盐度仍呈显著正相关（r=0.987，P<0.05）。处理96 h后，以盐度1.5%组血细胞密度最低，盐度3.5%组次之，而盐度2.0%、2.5%、3.0%组的血细胞密度组间差异不显著（P>0.05）。

2.2 盐度变化对单环刺螠SOD活力的影响

由图2可知，盐度变化对单环刺螠SOD活力的影响显著。除盐度2.5%组SOD活力略有波动外，其他组均呈先升后降趋势。处理6 h，盐度3.5%组SOD活力显著高于其他组，处理 48 h 后升至最高值，随后下降。盐度1.5%和2.0% 2组SOD活力上升幅度较小，于处理24 h升至最高。盐度3.0%组SOD活力在处理6 h时无明显变化，随着处理时间延长亦逐渐升高，至处理48 h升至最高，且上升幅度最大。处理96 h后，盐度1.5%和3.5% 2组SOD活力显著低于其他试验组（P<0.05），较盐度2.5%组分别下降54.53%和45.65%。

2.3 盐度变化对单环刺螠MDA含量的影响

由图3可知，盐度变化后各试验组MDA含量均呈先降后升的趋势，以盐度3.5%组MDA含量下降最为明显。盐度1.5%和3.5% 2组、盐度2.0%和3.0%2组分别于处理24、48 h時降至最低，随后逐渐上升。至处理96 h，以盐度1.5%组MDA含量最高，盐度3.5%组次之，其他3个试验组间相近（P>0.05），且MDA含量与SOD活力呈显著负相关（r=-0.969，P<0.05）。

2.4 盐度变化对单环刺螠ACP活力的影响

由图4可知，盐度变化后，单环刺螠ACP活力呈现2种变化趋势，由初始盐度2.5%下降至1.5%和2.0%，ACP活力呈现先降后升再降的趋势;而由盐度2.5%升高至3.0%和3.5%，ACP活力则呈现先升后降趋势。盐度1.5%和2.0%2组在处理6 h后，ACP活力显著低于对照组，随后回升，至处理24 h后升至最高值后下降。盐度3.0%组和3.5%组ACP活力分别处理72、48 h后升至最高，以盐度3.0%组上升幅度最大。处理96 h后，以盐度3.0%组ACP活力最高，盐度1.5%和3.5%2组显著低于对照组（P<0.05）。

3 讨论

3.1 盐度变化对单环刺螠血细胞密度的影响

无脊椎动物血细胞是其免疫功能的主要实施者，血细胞在发挥吞噬功能时还会释放一些免疫因子，与血淋巴中的其他免疫因子互相协同以抵御外来病原对机体的侵害[7]。据报道，盐度变化对血细胞有显著影响，降低和升高都会导致血细胞减少，而低盐度条件下血细胞减少更为显著[8-9]。但

Reid等研究发现，盐度在2.0%～4.0%范围内，菲律宾蛤仔（Ruditapes philippinarum）血细胞密度在盐度为2.0%时减少，在盐度为4.0%时显著增多[10]。本结果表明，盐度变化对单环刺螠血细胞密度有显著影响，短期内高盐度3.5%组单环刺螠血细胞密度显著增多，这与Reid等的高盐度胁迫下血细胞密度显著增多的研究结果[10]一致。随着处理时间的延长，盐度2.0%、2.5%和3.0%组的血细胞密度无显著差异，但盐度1.5%和3.5%2组血细胞密度显著低于其他试验组，与Zhao等对凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）的研究结果[11]相近。在处理6～48 h，单环刺螠的血细胞密度和盐度呈显著正相关，这可能由于盐度变化后，机体处于低渗或高渗环境中，为调整体内外渗透压的平衡而导致血细胞密度变化。长时间胁迫下，盐度15和35两组血细胞密度显著降低，表明单环刺螠处于不适宜盐度环境下其免疫力受到较大的影响。

3.2 盐度变化对单环刺螠SOD活力和MDA含量的影响

生物体在新陈代谢过程中会产生活性氧自由基，对机体可造成氧化损伤，而SOD可以清除过量的自由基，对保护机体免受自由基损害起着重要作用[12]。Wang等将盐度由2.5%变化至0.5%、1.5%和3.5%后96 h，凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）血液SOD活力分别下降52%、27%和24%[13]。郑慧等研究发现，盐度变化会引起刺参（Apostichopus japonicus）体腔液SOD活力降低[14]。本研究结果表明，盐度的升高或降低都会使单环刺螠SOD活力呈先升后降的趋势，表明机体在遭遇盐度突变时，会引发一系列生理应激反应，产生过量的氧自由基，诱发SOD活性增强，以降低盐度突变对机体的氧化损伤，增强免疫能力和对盐度突变的耐受能力，与高杉等对大竹蛏（Solen grandis）的研究结果[15]一致。盐度变化96 h后，盐度变化幅度较大的15和35两组SOD活力显著下降，表明机体的渗透调节负担过重会导致其抗氧化系统受损，尤以低盐的影响更为显著。

MDA是生物膜中多不饱和脂肪酸在活性氧自由基攻击下而引发脂质过氧化的产物，其含量能够直接反应体内脂质过氧化的强度和速率，可广泛用于氧化应激中自由基产生和生物膜氧化损伤程度的评价指标[16]。季延濱等将革胡子鲇（Claries lazera）的水体盐度升高96 h后，其血清MDA含量显著升高[17]。盐度变化后单环刺螠MDA含量均呈先降后升的趋势，以盐度1.5%和3.5%2组变化幅度较大，表明低盐度短时间的盐胁迫能引起机体应激反应，适当提高其免疫力，而长时间高盐度变化会造成较大的氧化损伤。本研究中MDA含量与SOD活力呈显著负相关，故可将SOD活力和MDA含量的长期变化用于评价盐度变化下单环刺螠的免疫状态。

3.3 盐度变化对单环刺螠ACP活力的影响

ACP是在酸性条件下，催化磷酸单酯水解的酶为溶酶体的标志酶，在溶酶体发挥正常生理功能及机体免疫中起重要作用[18]。印度明对虾（Fenneropenaeus indicus）在盐度变化后其ACP活力均呈先升后降的趋势，于72 h升至最高[19]。在盐度2.5%、3.5%、4.0%下，刺参体腔液ACP活力于10 d达到最高值后下降[14]。本研究中，由盐度2.5%升高至3.0%、3.5%，单环刺螠ACP活力先升后降，与上述研究结果相近。盐度3.0%组ACP活力升高幅度最大，且处理96 h后仍然显著高于盐度2.5%组，表明适当的盐度变化可刺激机体的免疫力有所提高。而由初始盐度2.5%下降至1.5%和2.0%，单环刺螠ACP活力表现为先下降，表明机体处在低盐环境下，进行渗透压调节需要消耗更多能量从而影响其免疫力。盐度变化96 h后，盐度2.0%组ACP活力与盐度2.5%组相近，表明适当的盐度下降后，机体通过一段时间调整可达到新的渗透平衡;而盐度1.5%和3.5%2组ACP活力显著低于对照组，表明过低和过高的盐度都会对机体免疫力产生不利影响。

综上所述，盐度变化对单环刺螠非特异性免疫有较大影响，盐度2.0%～3.0%为单环刺螠较适宜的环境条件，盐度1.5%和3.5%条件下其免疫力显著下降，以低盐环境下影响更为明显。在适当范围内，机体可通过自身的调节来适应环境中的盐度变化，但盐度的变化幅度较大会使机体的生理机能遭受胁迫，免疫力下降，可能引起疾病暴发。因此，在单环刺螠的养殖过程中，养殖水环境的盐度变化不容忽视，尤其是连续降雨造成养殖水体的盐度急剧下降时要注意及时换水。

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