陆地棉脂肪酸去饱和酶基因GhFAD2-1的克隆与表达分析

文凤 孙亮 刘峰

摘要：Δ12-脂肪酸去饱和酶基因FAD2-1是控制种子中单不饱和脂肪酸油酸（C18 ∶ 1）向多不饱和脂肪酸亚油酸（C18 ∶ 2）转化的关键基因，其表达水平决定植物油的营养价值与氧化稳定性。棉花GhFAD2-1基因的深入研究有利于采用脂肪酸代谢基因工程技术对棉仁中脂肪酸成分进行定向修饰和改造。采用同源克隆技术获得棉花品种新陆早33号的GhFAD2-1基因，该基因编码区全长 1 158 bp，共编码385个氨基酸;生物信息学分析结果表明，GhFAD2-1基因序列具有1个典型的FAD2结构域和1个FAD2-N端结构，其氨基酸序列与橄榄、芝麻、花生、油茶等作物的FAD2序列相似性较高，在75%～78%之间。利用qRT-PCR技术分析发现，GhFAD2-1基因的表达量随着棉籽的发育呈先升高后降低的趋势，开花后40 d达到其表达峰值。使用气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）测定其脂肪酸组成，结果表明，开花后0～40 d，C18 ∶ 1含量/C18 ∶ 2含量与GhFAD2-1基因表达量变化趋势相反。

关键词：棉花;GhFAD2-1;脂肪酸;qRT-PCR;GC-MS

中图分类号：Q785;S562.01   文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）12-0074-05

棉花是世界上最重要的纤维作物，同时也是重要的油料作物。棉籽脱壳后的棉仁中油脂含量为25%～39%[1]，是世界上次于棕榈、大豆、油菜、油葵、花生的第六大植物油来源。2016年我国棉籽产量约为677.59万t，棉籽油的产量约为110.00万t，是我国主要食用植物油之一。

单不饱和脂肪酸油酸（C18 ∶ 1）和多不饱和脂肪酸亚油酸（C18 ∶ 2）是植物油中的主要脂肪酸组分，这2种脂肪酸组分含量在油料作物种子中的相对比例决定了食用油的营养价值与氧化稳定性[2]。多不饱和脂肪酸亚油酸在贮藏过程中易氧化变质，且多不饱和脂肪酸通过氢化作用可产生反式脂肪酸及其异构体。反式脂肪酸会刺激身体合成胆固醇，过多的胆固醇高于细胞代谢所需，导致胆固醇集聚在血管中，易引发心血管疾病[3]。单不饱和脂肪酸能降低对人体健康有害的低密度胆固醇（LDL）水平，且其稳定性较高，富含 C18 ∶ 1 的食用植物油可较长时间地保存，在高温烹调时不易氧化变质[4]。因此，提高油酸的相对含量，增加食用植物油脂中油酸含量与亚油酸含量的比值，是油料作物品质改良的重要内容[5-8]。

在植物脂肪酸合成代谢过程中，Δ12-脂肪酸去饱和酶FAD2是催化油酸脱氢生成亚油酸的关键酶，其编码基因FAD2的表达水平直接调控了植物中油酸与亚油酸的相对含量与比例[9]。目前FAD2基因已从大豆（Glycine max）、玉米（Zea mays）、花生（Arachis hypogaea）、棉花（Gossypium hirsutum）、油葵（Helianthus annuus）、油菜（Brassica napus）和橄榄（Olea europaea）等多种植物中分离得到[10-15]。然而，目前关于棉花、大豆、油菜、花生等作物种子特异表达FAD2-1基因的调控机制却鲜有报道。研究种子FAD2-1基因的时空表达调控模式以及脂肪酸组分形成的生理学机制，是有效定向调控种子中油酸组分含量的前提。本研究于2016—2017年在石河子大学棉花研究所和绿洲生态实验室进行试验，以新疆石河子棉区栽培种新陆早33号为材料，克隆其种子脂肪酸去饱和酶基因GhFAD2-1，并对该基因编码蛋白进行序列分析;利用qRT-PCR检测GhFAD2-1在种子发育过程中的表达情况;同时用气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）分析种子发育过程中的脂肪酸组分，以期为进一步研究GhFAD2-1基因的调控机制、改良棉籽油的品质奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料、菌株、质粒及主要试剂

陆地棉（Gossypium hirsutum）品种新陆早33号、大肠杆菌菌株Escherichia coli XL1-Blue均由笔者所在实验室保存。Ex Taq DNA聚合酶、限制性内切酶、DNA Marker等购自宝生物工程（大连）有限公司。普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（DP209）、植物总RNA提取试剂盒（DP437，离心柱型）等购自天根生化科技（北京）有限公司。第1链反转录试剂盒（PrimeScriptTM 1st strand cDNA Synthesis Kit）、克隆载体 pGEM-T easy vector和SYBR Premix Ex TaqTM（Perfect Real Time）等购自宝日医生物技术（北京）有限公司（TaKaRa）。

1.2 GhFAD2-1基因的克隆

取新陆早33号花后35 d的棉花种子，去除外层软壳后，将棉仁在研钵中用液氮冷激后快速研磨，将粉末快速装入RNase-free的离心管中，保证样品不溶解，并让液氮挥发，采用植物總RNA提取试剂盒（DP437，离心柱型）提取总RNA，利用PrimeScriptTM 1st strand cDNA Synthesis Kit将1 μg总RNA反转录成cDNA。利用已知的FAD2-1基因序列信息（GenBank：HQ259410.1），设计特异性引物，上游：5′-ATGGGTGCCGGTGGTAGGA-3′，下游：5′-TTAGAACTTGTTACGATACC-3′。特异性引物由北京六合华大基因科技有限公司合成。以反转录总RNA获得的cDNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应条件为：94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35个循环;72 ℃ 10 min。目标条带回收步骤按照普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（DP209）的说明书进行。利用克隆载体连接试剂盒将回收片段连接到pGEM-T easy vector上，获得pGEM-T-FAD2-1。转化E.coli XL1-Blue，筛选抗氨苄青霉素的菌落，并进行菌落PCR鉴定和测序。