化学发光法联合定量PCR用于婴幼儿巨细胞病毒感染合并肺炎的诊断价值*

赖金甜， 李相新， 郑芬， 黄振强， 谭汝宏

佛山市妇幼保健院检验科(广东佛山 528000)

人巨细胞病毒(HCMV)是一种疱疹病毒科β亚科的具有双螺旋结构的DNA病毒[1]，基因结构复杂，碱基长度较长，属于条件致病病毒，主要易发生在免疫功能低下的机体中，特别是身体机能正在发育和免疫力低下的婴幼儿，并且容易继发细菌或真菌的感染，大大增加了治疗的难度，导致婴幼儿的死亡率大大提高，严重威胁婴幼儿患者的生命健康[2]。由于巨细胞病毒(CMV)具有组织和细胞的泛嗜性，因此在临床上的表现各异，主要会引发泌尿生殖系统、中枢神经系统和肝脏、血液循环系统等并发症，其中以并发肺炎最为常见[3]。我国是CMV感染的高发区域，有研究[4-5]发现在我国健康人群IgG抗体检测中，CMV的阳性感染率高于70%，而孕产妇CMV的感染率更是高达90%，同时，3岁以下婴幼儿的感染率也是高达80%，若婴幼儿CMV合并肺炎患者无法得到及时准确的诊断和治疗，则会导致病程发展迅速，病情凶险，危及生命，因此，寻找临床上的一种快速准确的检验方法对检测婴幼儿CMV感染并及时采取救治，具有非常重要的临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2016年10月到2018年8月在我院接受治疗的婴幼儿CMV合并肺炎感染的患儿89例，年龄为3个月至3岁，平均(2.1±0.2)岁，其中男童48例，女童41例；同时选择在我院体检的健康婴幼儿83例作为健康对照组，男童43例，女童40例，年龄为0～3岁，平均(2.2±0.1)岁。诊断标准：(1)发热并且持续3 d以上体温>38℃；(2)呼吸困难、唇面紫绀、无痰性咳嗽、胸闷等；(3)胸片有间质性肺炎表现；(4)关节痛；(5)胃肠道溃疡、出血等；(6)具备以上临床表现，排除其他微生物或病原体感染。经检验CMV-IgM和(或)CMV-DNA阳性者可诊断为CMV合并肺炎患儿。两组患者在年龄和性别差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究已获得我院伦理委员会批准，所有纳入研究的婴幼儿均获得其监护人的同意并签署知情同意书。

1.2 样本收集 抽取空腹受试者的静脉血2 mL，室温静置1 h后，以2 500 r/min的转速离心20 min，分离血清进行检测。

1.3 检测方法 化学发光法：通过罗氏Cobase601电化学发光分析仪及其原装试剂，严格按照说明书进行操作，其中IgM检测结果以Index>0.50为阳性感染。荧光定量PCR法：采用ABI 7500型实时荧光定量PCR仪和中山大学达安基因股份有限公司的试剂盒检测CMV-DNA，其中以CMV-DNA≥1×103拷贝/mL为阳性。同时，利用ELISA试剂盒(均来自武汉华美生物基因工程有限公司)检测血清中IFN-γ、IL-4和IL-6的表达含量，辅助对CMV合并肺炎婴幼儿患者的检测。

2 结果

2.1 CMV-DNA和CMV-IgM检测结果 在89例CMV阳性婴幼儿患者中，血清CMV-IgM阳性的有77例，血清中CMV-DNA阳性的有81例，双阳性的有73例，双阴性的有4例，血清中CMV-DNA阳性而CMV-IgM阴性的有8例，而血清中CMV-IgM阳性而CMV-DNA阴性的有4例。

2.2 两组血清中IFN-γ、IL-4和IL-6的含量比较 CMV合并肺炎阳性患儿血清中IFN-γ的含量明显高于健康对照组，而血清中IL-4和IL-6的含量明显低于健康对照组，其组间差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 两组患者血清中IFN-γ、IL-4和IL-6的含量比较

组别例数IFN-γIL-4IL-6CMV患儿8986.96±7.29*28.49±6.61*34.62±6.53*健康对照组8321.27±4.7658.39±10.0379.47±9.11

*与健康对照组比较P<0.05

2.3 早期诊断分析 多种方法联合检测CMV感染合并肺炎的敏感度为95.5%，特异度为91.6%，准确率为96.2%。见表2和图1。

表2 两组患者血清中CMV-DNA联合IFN-γ、IL-4和IL-6的早期诊断分析 %

图1 多种方法联合检测婴幼儿CMV感染合并肺炎的早期诊断ROC曲线分析

3 讨论

CMV感染在大多数人一生的不同时期都可能会发生，与性别、年龄、生活环境、社会因素和经济条件等多种因素都有一定的相关性[6-7]。作为免疫力低下的群体代表之一，婴幼儿是最容易受到CMV感染的，且CMV感染的同时，往往会影响到消化、呼吸、血液系统等，从而导致婴幼儿营养不良、肺炎、肝功能损害、肾脏损害和血液系统疾病等，并且对器官造成不可逆的损伤，大大提高了病死率，威胁着患儿的生命健康[8]。研究显示，0～1周岁婴儿CMV阳性感染率高达80%，一旦机体免疫功能低下，就可以直接诱发巨细胞病毒的活化，引起活动性感染，其中在婴幼儿患者中，最为常见的就是CMV合并肺炎[4]。由于对CMV肺炎早期缺乏特异性的检测指标，很容易会导致误诊，致使病情延误；同时，由于CMV具有泛嗜性，可以在免疫力低下的患者中引起多个器官的病变，且临床表现各异[4]，无法进行有效的鉴别诊断，严重影响了婴幼儿患者得到及时有效的救治，危害了婴幼儿患者的健康安全[9]。因此，寻找一种更为快速准确的早期检测手段和检测指标成为了临床研究的热点。

当机体感染CMV后，就会出现特异性的IgM、IgG、IgE、IgA等抗体，其中，当CMV潜伏期感染10 d后即可在血清中检测出特异性IgM抗体，而6周左右其抗体水平即可达到峰值，12～16周时，抗体消失[4]。因此，血清中IgM、IgG抗体的检测结果呈现阳性，可以间接表示机体出现了CMV感染，或潜伏的CMV感染被活化或近期发生了CMV活动性感染，可见IgM、IgG是鉴别诊断CMV活动性感染的重要指标[10]。目前，主要通过实验室病毒培养及病理鉴定HCMV感染作为主要的诊断方法和标准，但这种方法主要是观察细胞病理学变化，检测周期较长，无法实现临床的快速检测，而临床上多采用ELISA法、化学发光法、胶体金法和荧光定量PCR法进行检测[11-13]。化学发光法是一种分子发光光谱分析法，主要利用仪器对体系化学发光强度的检测，从而确定待测物含量的一种痕量分析方法，可以对IgM、IgG抗体水平进行定量检测，而且整个过程均由仪器完成，极大程度地避免了操作者、环境等外界因素对检测过程和结果判断的误差，对于IgM、IgG抗体阳性的检出率、敏感度、特异度均明显优于ELISA法和胶体金法，适用于临床大样本的初检。本研究中，对89例CMV阳性患儿进行检测，血清CMV-IgM阳性的有77例，而血清中CMV-IgM阴性的有12例，阳性检出率为86.51%，准确率为87.2%，虽然阳性检出率较高，但仍有一定程度的误差。因此，本研究结合荧光定量PCR法来检测血清中CMV-DNA，以期提高对CMV感染诊断的准确率。荧光定量PCR法是检测特异度和敏感度较高，且可以在低病毒含量下进行有效检测的一种技术，具有极高的临床应用价值，是诊断CMV感染较为敏感的方法之一[14-16]。本研究利用荧光定量PCR对89例CMV阳性患者进行检测，其中CMV-DNA阳性的有81例，而CMV-DNA阴性的有4例，阳性检出率为91.01%，准确率为89.5%，与对血清中CMV-IgM的检测相比，一定程度上提高了对CMV感染检测的准确率。

此外，研究表明[17-18]，当机体受到CMV感染后会出现的免疫紊乱的情况，而其机制非常复杂，目前主要认为与机体内细胞因子的作用和失衡具有密不可分的关系。细胞因子是一类小分子多肽类物质，是由免疫细胞分泌，并对细胞功能发挥重要的调节作用，一旦细胞因子水平发生失衡，则表明机体免疫功能出现了紊乱。机体内Th1和Th2细胞是免疫细胞主要的分化形式，Th1细胞主要分泌IFN-γ、TNF-β等因子，介导了细胞毒性和炎症反应，而Th2细胞主要分泌IL-4、IL-6和IL-10等因子，主要通过刺激B细胞分泌大量免疫蛋白，参与体液免疫反应[19]。因此，常常检测IFN-γ、IL-4和IL-6的含量来反映机体的免疫应答状态。本研究发现，CMV合并肺炎阳性患者血清中IFN-γ的含量明显高于健康对照组(P<0.05)，经统计分析后得到诊断的准确率为72.6%，阈值为95.0 pg/mL，而血清中IL-4和IL-6的含量明显低于健康对照组(P<0.05)，两个指标诊断的准确率分别为75.6%和67.6%，阈值分别为35.05 pg/mL和51.75 pg/mL，但统计发现IL-6的含量检测并不具有统计学意义，因此后续不纳入联合检测内。

综上所述，通过ELISA法检测血清中IFN-γ、IL-4和IL-6的含量变化，与化学发光法、荧光定量PCR法的检测结果相结合，可以更加准确地判断机体是否发生了CMV活动性感染，对于早期快速准确诊断CMV感染合并肺炎具有非常重要的指导意义。但本研究中临床样本量只有89例，样本量较少，其检测结果可能会存在一定程度的偏差，代表性不够，之后的研究将会加大临床样本的收集和检测，以期提高联合检测的准确度和可信度。