野生和栽培蓝靛果中花色苷含量的测定及分析*

●齐会娟 刘德文 李中宾 张利军 张春英 高 尊

（大兴安岭地区农业林业科学研究院 黑龙江 大兴安岭 165100）

蓝靛果（Lonicera caerulea L.var.edulis Turcz.exHerd.）是忍冬科忍冬属蓝果忍冬的变种。浆果味道酸甜可口，可生食，又可提供色素，亦可酿酒、作饮料和果酱，富含维生素、有机酸、抗坏血酸、糖类，果实中还含有丰富的活性物质，如单宁、花色苷、黄酮、皂苷等，具有降血压、抗疲劳、保肝、心脑血管保护、抗菌、抗氧化、改善免疫功能、调节胆固醇等药理作用[1,2]，有极高的药用价值。据报道，蓝靛果花色苷可降低乙醇对肝脏所造成的损伤[3]，蓝靛果花色苷通过提高高脂血症大鼠肝脏内LXR、CYP7a1 m RNA表达，降低PPARmRNA表达来调节高脂血症大鼠的血脂水平，预防动脉硬化的发生[4]，因此花色苷除了作为食用色素外，它还对人类的肿瘤、衰老、心血管病等疾病的预防与治疗有重要的意义[5]；蓝靛果忍冬相较于其他植物含有更为丰富的花色苷，因而受到各国学者的高度重视[6]，但是蓝靛果果实中有益于健康的活性物质的含量与其生长环境、地理位置密切相关，不同的生长环境果实中的花色苷含量不同[7]。本文以大兴安岭地区同一资源圃中野生蓝靛果、栽培蓝靛果BLY、DN-1、DN-2、DN-3、BL、EF、ED、RB为材料，采用pH示差法、O.D.法和高效液相色谱法对9 种浆果中的总花色苷进行测定，并进行对比分析，拟为进一步开发利用大兴安岭地区蓝靛果浆果资源提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料 大兴安岭地区野生蓝靛果、栽培蓝靛果BLY、DN-1、DN-2、DN-3、BL、EF、ED、RB（2018年6月20日采摘于大兴安岭地区农业林业科学研究院实验基地蓝靛果资源圃），放置于 20℃冰箱中保存。

标准品矢车菊素-3-O-葡萄糖苷（Cy3G）（美国Chromadex）；色谱纯乙腈、甲醇（J＆K.SCITIFIC LTD.北京百灵威科技有限公司），色谱纯甲酸（天津市科密欧化学试剂有限公司）；无水乙醇、盐酸、氢氧化钠、氯化钾、醋酸钠等均为分析纯。

1.1.2 仪器设备 765 紫外可见分光光度计（INESA），上海精密科学仪器有限公司；BA110S精密电子天平，Sartorius仪器(上海)有限公司；UP-30 纯水机，上海本昂科学仪器有限公司；沃特世e2695 高效液相色谱仪（Waters）；VOSHIN-1000DW超声细胞破碎仪，无锡沃信仪器有限公司；DS-1 高速组织捣碎机，上海精科实业有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 蓝靛果果实花色苷的提取 准确称取匀浆后的样品5g于150mL烧杯中，加入95%的乙醇:1.5mol/L的盐酸为85:15(体积比)的提取剂100mL，静止30min后，超声15min两次，合并抽滤液转移至250mL容量瓶，滤渣加入30～40mL提取剂浸提3～4 次，过滤洗涤后用提取剂定容至250mL[8]。

1.2.2 O.D.法测定总花色苷含量 准确移取1.2.1 中提取液稀释25 倍后在波长535nm处测定吸光值[8]，计算公式如下：

总花色苷含量 (mg/100g)=OD×DV×100×TEV/CrW×1/98.2

式中，OD为稀释后溶液的吸光值；DV为稀释倍数；TEV为提取液总体积；CrW为样品质量(g)。

1.2.3 pH示差法测定总花色苷含量

1.2.3.1 缓冲液的配制。pH1.0 缓冲液：精密称取1.49g氯化钾，用蒸馏水定容至100mL，精密量取1.7mL盐酸，用蒸馏水定容至100mL；将0.2mol/L氯化钾与0.2mol/L盐酸按体积比25:67 的比例混合，用氯化钾溶液调节pH(1.0±0.1)。pH4.5 缓冲液:精密称取1.64g乙酸钠，用蒸馏水定容至100mL，用盐酸调节pH(4.5±0.1)。

1.2.3.2 总花色苷含量测定方法。根据花色苷在pH1.0 时，在 520nm波长处有最大光吸收，而在pH4.5 时，花色苷转变为无色查尔酮形式，在520nm波长处无吸收，所以可以利用pH示差法计算溶液中总花色苷的含量。准确移取1.2.1 中的提取液样品1mL 2 份，将pH1.0 的氯化钾和pH4.5 的醋酸钠缓冲溶液分别定容至10mL，放置2h，在520nm和700nm处分别测定其吸光度，计算总花色苷含量(以矢车菊素-3-葡萄糖苷表示)[9]。计算公式如下:

总花色苷含量(mg/100g)=(A×V×n×M)/( ×m)×100

式中，A=pH 1.0－pH4.5；V为提取液总体积；n为稀释倍数；M为矢车菊-3-葡萄糖苷(Cy-3-Glu)的相对分子质量 (449)；为Cy-3-Glu的消光系数 (29 600)；m为样品质量(g)。

1.2.4 HPLC法测定总花色苷含量

1.2.4.1 色谱条件。色谱柱为岛津C18 柱，4.6mm（内径）×250mm（长）×5m（粒径）。花青素（包括花青素苷和花青素苷元）的检测波长为525nm。流动相组成为，A相：乙腈:甲醇=85:15；B相：10%甲酸水溶液。洗脱比例为：0min，8%A；15min，25%A；20min，8%A。柱温35℃，流速0.8mL/min，进样体积10L，采用waters 2489 UV检测器，用empower（3.0 版本）软件分析[10]。

1.2.4.2 标准系列。准确称取矢车菊素-3-葡萄糖苷标准品用2%的甲酸甲醇溶液定容稀释至浓度为0.5mg/mL，分别稀释至浓度为0.25mg/mL、0.125mg/mL、0.0625mg/mL、0.03125mg/mL。

1.2.4.3 样品分析。取1.2.1 中提取液过0.45m滤膜后，按照1.2.4.1 中色谱条件进样。通过检测出的总峰面积与已知标准品的峰面积进行比对，计算出相对于标准品Cy3G的总花色苷含量和对应的矢车菊素-3-葡萄糖苷的含量。

1.3 数据处理

采用Excel 2010 对上述数据进行处理，所有指标均进行了3 次平行样测定。

2 结果与分析

2.1 花色苷标准曲线

见图1、图2和图3。

图1 标准品高效液相色谱图

以5 个浓度系列为横坐标，峰面积为纵坐标得到峰1 和峰2 对应的两个拟合方程如下:

两个方程拟合系数R2均接近于1，适合用于各蓝靛果样品中对总花色苷含量和对应的矢车菊素-3-葡萄糖苷的含量的计算。

图中由上往下依次为野生蓝靛果、栽培蓝靛果DN-2、BLY、DN-3、BL、EF、ED、RB、DN-1、矢车菊-3-葡萄糖苷标准（Cy3G）谱图。

图2 不同品种蓝靛果果实中花色苷高效液相色谱法定量谱图对比

图3 不同品种蓝靛果果实中花色苷高效液相色谱法重叠谱图

由图2、图3 可以看出9 种蓝靛果果实中都有矢车菊-3-葡萄糖苷单体，各种果实的色谱图中看出峰的个数不同，野生蓝靛果、栽培蓝靛果BLY、DN-1、DN-2、DN-3、BL、EF、ED、RB中峰的个数分别为 8、11、9、8、9、8、7、3、4，因此各种果实中花色苷种类不同。

2.2 蓝靛果果实中总花色苷比较分析

见表1。

表1 蓝靛果果实中总花色苷比较分析

由表1 可以看出，采用O.D.法测定野生蓝靛果、栽培蓝靛果BLY、DN-1、DN-2、DN-3、BL、EF、ED、RB中总花色苷含量按照含量高低排序为DN-1 ＞BLY＞BL＞EF＞DN-2 ＞DN-3 ＞野生蓝靛果＞ED＞RB；采用pH示差法测定野生蓝靛果、栽培蓝靛果BLY、DN-1、DN-2、DN-3、BL、EF、ED、RB中总花色苷含量按照含量高低排序为DN-1＞BLY＞BL＞EF＞DN-3 ＞DN-2 ＞野生蓝靛果＞ED＞RB；采用HPLC法测定野生蓝靛果、栽培蓝靛果BLY、DN-1、DN-2、DN-3、BL、EF、ED、RB中总花色苷含量按照含量高低排序为DN-1 ＞BLY＞DN-3 ＞野生蓝靛果＞DN-2 ＞BL＞EF＞ED＞RB；矢车菊-3-葡萄糖苷含量按照含量高低排序为DN-1＞BLY＞DN-3 ＞野生蓝靛果＞DN-2 ＞BL＞EF＞ED＞RB；其中矢车菊-3-葡萄糖苷含量分别占pH示差法测定总花色苷含量的96.44%、70.77%、72.32%、48.34%、73.90%、35.99%、33.47%、27.83%、30.23%，按照比率高低排序为野生蓝靛果＞DN-3 ＞DN-1 ＞BLY＞DN-2 ＞BL＞EF＞RB＞ED；矢车菊-3-葡萄糖苷含量分别占HPLC法测定总花色苷含量的 76.24%、68.86%、74.25%、73.08%、73.47%、73.63%、74.35%、71.06%、65.32%，按照比率高低排序为野生蓝靛果＞EF＞DN-1 ＞BL＞DN-3 ＞DN-2 ＞ED＞BLY＞RB。

同时采用3 种方法测定，栽培品种DN-1 每百克中总花色苷和矢车菊-3-葡萄糖苷的含量最高分别为502.991mg、363.75mg，其中矢车菊-3-葡萄糖苷占总花色苷含量的72.32%，与其他8 种蓝靛果相比差异极显著；栽培品种RB每百克中总花色苷和矢车菊-3-葡萄糖苷的含量最低分别为 118.109mg、35.70mg，其中矢车菊-3-葡萄糖苷占总花色苷含量的30.23%。因此栽培品种DN-1 从花色苷含量角度来看有较高的营养价值，野生蓝靛果居中，而RB营养价值较低。

图4 蓝靛果果实中不同方法测定花色苷含量对比

由图4 可以看出，同一样品用PH示差法测定蓝靛果中总花色苷含量数值高于O.D.法测定结果，不同品种蓝靛果中矢车菊-3-葡萄糖苷的含量各不相同，矢车菊-3-葡萄糖苷的含量占pH示差法测定总花色苷含量的比率也各不相同，不成正比例关系；矢车菊-3-葡萄糖苷的含量占HPLC法测定总花色苷含量的比率相近，最大差值为10.93%；根据HPLC总面积法测定野生蓝靛果总花色苷含量高于PH示差法和O.D.法，测定栽培品种BLY、DN-1 和DN-3 中总花色苷含量与PH示差法基本一致，测定栽培品种DN-2、BL、EF、ED和RB中总花色苷含量均低于PH示差法和O.D.法，同时采用三种方法测定栽培品种ED和RB中总花色苷含量和矢车菊-3-葡萄糖苷单体含量都是最低的。EF、ED和RB中PH示差法和O.D.法测定总花色苷含量结果基本一致，均高于HPLC法；因此，O.D.法不适用于测定总花色苷和矢车菊-3-葡萄糖苷含量高的果实。3 种方法测定结果的差异性可能与果实中色素和花色苷单体种类不同有关。

3 结论

大兴安岭地区每百克野生蓝靛果中花色苷含量为273.25mg，高于伊春地区野生蓝靛果的花色苷含量174.220mg[11]，大兴安岭地区栽培品种DN-1 中每百克花色苷含量为502.991mg，高于黑河栽培品种“加洛奇卡”花色苷含量322.64mg[12]，说明大兴安岭地区特殊的地理位置有利于蓝靛果树种中活性物质花色苷的积累；同时采用PH示差法、O.D.法和高效液相色谱法测定各品种之间总花色苷含量差异性显著，花色苷含量丰富的果实宜采用PH示差法测定。栽培品种DN-1 中总花色苷含量最高，RB中总花色苷含量最低；为大兴安岭地区蓝靛果的开发和利用提供了数据支撑，而每个品种中花色苷的具体类型是需要再进一步研究的课题。