人参水煎煮的科学性探索——水煎煮引发人参皂苷化学结构的转化△

杨秀伟，张雷

北京大学 药学院 天然药物学系/天然药物及仿生药物国家重点实验室，北京 100191

传统中药人参(Ginseng Radix et Rhizoma)系五加科多年生草本植物人参PanaxginsengC.A.Mey.的干燥根和根茎，驰名中外，获誉“百草之王”。早在远古皇帝时代，有关人参的神奇功效就已为人所知，人参已有4000多年的应用历史；为了满足需要，西晋末年，已经开始栽培人参，距今已有1600多年的历史。有关人参的记载，见于春秋时期越国宰相范蠡著《范子计然》一书，书中有“人参出上党，状类人形者善”的描述。我国最早的药学典籍《神农本草经》记载“人参味甘，主补五脏、安精神、定魂魄、止惊悸、除邪气、明目、开心、益智，久服轻身延年”。东汉时期名医张仲景所著《伤寒论》一书中共有113个成方，其中含有人参的配方达21个，并论述人参具有“温补、滋润、强壮、强精、保温、增强视力、安定精神”等作用。从古至今，人参或以“独参汤”形式药物应用，或以“配方”形式药物应用，民间作为补品煲汤饮用。自1963年科学家从人参中分离鉴定出人参皂苷(ginsenoside，G)[1-2]以来，现代科学研究已充分证明，人参皂苷几乎反映了人参的全部药理学作用。由于人参为水煎剂形式用药，本文探讨人参水煎煮的科学性——水煎煮引发人参皂苷化学结构的转化。

1 仪器与材料

1.1 仪器

岛津LCMS-8050超高效液相色谱-质谱联用仪，包括Nexera X2 UFLC液相系统：LC-30AD二元泵、SIL-30AC自动进样器、SPD-M30A检测器、CTO-20AC柱温箱；8050型三重四级杆定量质谱：配备ESI离子源和LabSolution工作站；Mettler XS105DU十万分之一电子天平(METTLER TOLEDO，Zurich，Switzerland)；AR4120型万分之一电子天平[奥豪斯国际贸易(上海)有限公司]；KQ5200超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司，功率：200 W，频率：40 kHz)。

1.2 材料

人参饮片(批号：PG-Y-201606)购自河北安国药材市场，经本文作者之一杨秀伟教授鉴定为PanaxginsengC.A.Mey.的干燥根和根茎。

对照品人参皂苷G-Re(1)、G-Rb1(2)、20(S)-G-Rh1(3)、20(S)-G-Rg2(4)、20(R)-G-Rg2(5)、G-Rc(6)、20(R)-G-Rh1(7)、G-Rb2(8)、G-Rb3(9)、G-Rd(10)、G-Rg6(11)、G-F4(12)、G-Rk3(13)、G-Rh4(14)、20(S)-G-Rg3(15)、20(R)-G-Rg3(16)、20(S)-PPT(17)、20(R)-PPT(18)、G-Rk1(19)、G-Rg5(20)、20(S)-G-Rh2(21)、20(R)-G-Rh2(22)、20(S)-PPD(23)、20(R)-PPD(24)，系本课题组从生晒参[3]、红参[4]、人参茎叶[5]或人参茎叶总皂苷酸水解产物[6]中分离制备，纯度经LC-MS验证均大于98%。以上24个对照品的结构式见图3～4。

LC-MS级别乙腈和甲醇购自Fisher Scientific Inc.(Pittsburgh，PA，USA)；色谱纯级别乙腈、甲醇为天津西华特种试剂厂产品；超纯水(18 MΩ·cm-1)为本实验室用Milli-Q Advantage A10(Millipore，Billerica，USA)制水机自制；HPLC级别醋酸铵购自Sigma-Aldrich(Lot#BCBK6717V，Sigma-Aldrich，Co.，MO，USA)。

2 实验条件和方法

2.1 实验条件

液质分析C18色谱柱为Waters ACQUITY UPLC©BEH Shield RP18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm，Part#186002854，Ser# 01603514816023，Made in Ireland)；配有相同填料预柱Waters ACQUITY UPLC©BEH Shield RP18VanGuardTM Pre-Column(5 mm×2.1 mm，1.7 μm，Part#186003977，Lot#0158351601，Made in Ireland)。流动相为0.5 mmol·L-1醋酸铵水溶液(流动相A)和乙腈(流动相B)。采用梯度洗脱方式，梯度洗脱程序：0～3 min，20%～22%B；3～5 min，22%～30%B；5～9 min，30%～33%B；9～11 min，33%～35%B；11～13 min，35%～42%B；13～23 min，42%～47%B；23～24 min，47%～52%B；24～29 min，52%～55%B；29～29.1 min，55%～60%B；29.1～34 min，60%～65%B；34～36 min，65%～95%B。流速设为0.4 mL·min-1，柱温控制在30 ℃，进样体积为1 μL。

质谱参数优化结果如下：雾化气流速：3 L·min-1；干燥气流速：10 L·min-1；加热气流速：10 L·min-1；接口加热器温度：300 ℃；脱溶剂管温度：250 ℃；接口电压：-3.0 kV；检测器电压：1.80 kV。电离源为电喷雾离子源，扫描方式为多反应监测，扫描模式为负离子模式。

2.2 混合对照品溶液的配制

精密称取各对照品适量，溶解于质谱级别甲醇中，制成质量浓度为1.0 mg·mL-1的对照品储备液，分别移取适量储备液混合并稀释制成混合对照品母液。连续稀释混合对照品母液得到一系列混合对照品线性工作液。

2.3 分析样品的制备

2.3.1 水超声提取 人参饮片粉碎过40目筛，准确称取1 g加入40 mL水，常温下超声提取两次，每次1 h，过滤，即得25 mg·mL-1(以生药计)样品溶液。再次用水稀释至0.5 mg·mL-1(以生药计)，平行制备两份样品。

2.3.2 水回流提取 称取人参饮片5 g，加入275 mL蒸馏水，水回流提取2 h，过滤。滤渣再次加入275 mL蒸馏水回流2 h，过滤后合并两次滤液，水浴蒸至约50 mL，加入100 mL乙醇使醇浓度约为65%，4 ℃静置过夜，在3000 r·min-1离心10 min，收集上清。上清减压浓缩除去乙醇后冷冻干燥，称质量，密封保存。分析前分别称取适量提取物溶解于甲醇制成25、0.5 mg·mL-1(以生药计)的样品溶液，平行制备两份样品。

3 结果与讨论

在本课题组前期[7]对人参皂苷UFLC-MS/MS研究的基础上，本研究发现，所有分析物均在负离子模式下有最大的响应。各分析物优化得到的保留时间、离子对信息、Q1能量、碰撞能量、Q3能量和滞留时间信息见表1。

表1 24个分析物保留时间及最优离子化参数

分别对分析方法的专属性、系统适用性、线性、定量下限和检测下限、重复性、提取回收率和稳定性进行了方法学考察，结果表明，该方法能够用于上述24个分析物的含量测定[8]。(数据略)。

图1为水超声法提取人参饮片得到的MRM叠加图，图2为水回流提取人参饮片得到的MRM叠加图，根据建立的UFLC-MS/MS对两种提取物的定量分析结果总结见表2。

图1 水超声提取样品中24个分析物的MRM叠加图

图2 水回流提取样品中24个分析物的MRM叠加图

常规上，如果将中药粉末置于水中在常温下提取，获得的基本上是天然的原形化合物；而热水回流提取可能得到人工产物。一般来说，人参中的原人参二醇型(protopanaxadiol，PPD)达玛烷四环三萜在C-3或C-20结合糖链，天然者的手性C-20呈S型；原人参三醇型(protopanaxatriol，PPT)达玛烷四环三萜在C-6或C-20结合糖链，天然者的手性C-20呈S型。表2定量分析结果表明，室温下超声提取，人参饮片中化合物3[20(S)-G-Rh1]、4[20(S)-G-Rg2]等收率较低，但热回流的情况下其收率上扬。同时也可以观察到，人参饮片中不含有它们的C-20差向异构体(epimer)，即化合物5[20(R)-G-Rg2]和7[20(R)-G-Rh1]，但在热回流的情况下出现了化合物5和7，此已被许多研究所证实，即在人参加热提取或煎煮处理中，天然的20(S)型PPD和/或PPT达玛烷四环三萜易向20(R)型差向异构体转化，这种转化的结果不仅表现在它们溶解度上的改变，而且对其生物活性具有很大影响[2]，如表3所示的某些达玛烷四环三萜对肿瘤细胞的细胞毒活性。

表2 不同提取方法人参提取物中人参皂苷的含量 mg·g-1

注：—表示未检测到。

表3 某些达玛烷四环三萜对肿瘤细胞的细胞毒活性 μmol·L-1

表2结果显示，化合物5、7、11～24不存在于人参饮片中，但在热回流处理人参饮片的情况下，这些化合物出现了。化合物1(G-Re)、2(G-Rb1)、6(G-Rc)、8(G-Rb2)、9(G-Rb3)和10(G-Rd)是生晒参中普通化合物[1，9-10]，除G-Rd外，它们应该是人参中的天然化合物，G-Rd很可能是天然人参皂苷生物合成的中间体或降解产物，有待研究证实。根据表2的检测结果和化合物的化学结构特性，推测PPD型人参皂苷可能通过热致活化水提供的能量促进糖苷键断裂，发生非酶促反应，产生一系列降解产物，见图3。G-Rb1、G-Rb2、G-Rb3、G-Rc等作为起始物逐级降解，产生结构多样性的降解产物。

从表2结果也可看出，随着煎煮，G-Rb1、G-Rb2、G-Rb3、G-Rc等的收量也在提高，可能来源于G-Ra1、G-Ra2、G-Ra3、G-Rs1、G-Rs2、G-Rs3[1]，丙二酰基人参皂苷(malonylginsenoside，MG)Rb1、Rb2、Rc等。作为PPT型人参皂苷可能通过热致活化水提供的能量促进糖苷键断裂，发生非酶促反应，产生一系列降解产物，见图4。典型的降解反应，如从G-Re开始等，产生少糖基的稀有人参皂苷(rare ginsenoside)。

图3 水煎煮所致PPD型人参皂苷的可能降解途径

图4 煎煮所致PPT型人参皂苷的可能降解途径

4 讨论

人参中的G-Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Re、Rg1等称之为普通人参皂苷，存在于生晒参中。而目前将它们的降解、少糖基产物称之为稀有人参皂苷，如G-Rg5、Rh1、Rh2、Rh3、Rh4、Rk1、Rk2、Rk3等。由于稀有人参皂苷较普通人参皂苷的糖基少，脂溶性相对增强，相对易于渗透组织器官或细胞，容易到达“靶点”发挥作用。在SIRT1(silent information regulator two homologue 1)模型研究中，以G-Rb1为例，在10、20 μmol·L-1对SIRT1活性无激活作用，而其降解产物稀有人参皂苷20(S)-G-Rg3、20(R)-G-Rg3、G-Rg5[11]以及20(S)-PPD和20(R)-PPD[12]具有较强的SIRT1激活作用；在PPT型皂苷中，以G-Re为例，在10、20 μmol·L-1对SIRT1活性无激活作用，而其降解产物稀有人参皂苷G-F4、G-Rh4[11]以及20(S)-PPT和20(R)-PPT[12]具有较强的SIRT1激活作用，且有不同的药代动力学行为[13-15]，无论是PPD型还是PPT型人参皂苷，总体趋势是糖基越少SIRT1激活活性越强。现代研究表明，SIRT1尤其是SIRT3与线粒体的能量代谢密切相关，此与人参传统功效的“大补元气”一致，提示其可能是人参延缓衰老的作用物质。普通人参皂苷向稀有人参皂苷的转化，改变了普通人参皂苷的活性[16]。如在临床上，更善于用红参治疗癌症。人参经过煎煮，G-Rg3含量大幅上升，G-Rg3已应用于临床治疗癌症。

稀有人参皂苷的作用也是多方面的，但近年在癌症、心脑血管疾病、肺纤维化疾病以及延缓衰老等方面的研究相对较多[2，17-21]，有了相关的抗癌产品。构效关系研究[22-23]表明，某些稀有人参皂苷的抗癌细胞增殖大致有如下趋势：G-Rk2≈G-Rh3>G-Rh2>G-Rk1≈G-Rg5>G-Rg3>G-Rh1，而Δ20，21PPD≈Δ20，22PPD>Δ20，21PPT≈Δ20，22PPT。有关不同稀有人参皂苷抗不同癌细胞增殖，资料公布的上海药明康德合同研究组织(Contract Research Organization；CRO)测试结果见表4，具有一定的先导性。对人参地上部分化学物质的研究[12，22，24-27]提示含有更丰富的稀有人参皂苷。

人参方药热水煎煮，由水分子提供的活化能使人参皂苷化学结构发生变化，产生的稀有人参皂苷化学结构多样性更丰富，体现了人参生物活性的多样性。从对红参化学成分的研究[4，7，21]，也佐证了人参水煎煮的科学内涵，而与用70%乙醇水溶液提取具有明显的区别[28]。

表4 上海药明康德CRO测试的某些稀有人参皂苷的细胞毒活性结果 μmol·L-1