禽源多杀性巴氏杆菌的分离及生物学鉴定

陶 娅，王铉皓，李军朝，徐 磊，朱永江，吴铁花，刘慧谋，王彦红，3

(1.扬州大学兽医学院,江苏 扬州225009；2.江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心,江苏 扬州225009；3.江苏省人兽共患病学重点实验室,江苏 扬州225009)

多杀性巴氏杆菌(Pm)可以导致家畜和禽类的多种巴氏杆菌病,该菌可引起鸡、鸭等禽类的禽霍乱。鸡、鸭等禽类暴发禽霍乱时多表现为突然发病,同时伴有下痢呈败血性的症状,该病暴发时其发病率与死亡率都极高,给家禽养殖业带来重大的损失和威胁。禽霍乱主要侵害对象为成年禽类,以性成熟后的禽类最为易感,暴发季节主要在夏季、秋季和冬季,这种季节性的流行主要是由于环境因素影响造成的[1],因此,2017 年夏、秋季江苏各地散养禽类暴发禽霍乱是由于7 ～9 月份温热多雨,环境潮湿,病原菌在场地不能自然净化。更为严重的是该病一旦暴发,在发病禽类舍饲内很难被完全清除,禽霍乱可以在同一场地连续发生[2]。将禽霍乱病例进行细菌分离、分子鉴定、药敏试验,为该病的临床用药和防控提供指导。

1 材料与方法

1.1 试剂 采用购自杭州天和微生物试剂有限公司的绵羊血和琼脂粉,按照通用组方配置成绵羊血琼脂平板和麦康凯琼脂平板。药敏试纸片,购自杭州天和微生物试剂有限公司。本次试验所用引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。测序由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

1.2 细菌分离 2017 年1 月-12 月间于扬州大学动物医院畜禽门诊部收集禽霍乱病料,共收集到12份病料(详见表1)。采集病禽的肝脏、心脏和脾脏等主要病变器官,按照无菌要求,用接种环挑取病料接种于绵羊血琼脂培养基上,在37 ℃培养箱内培养24 h 后观察菌落生长情况,将生长良好的单个菌落进行纯化传代分别接种于绵羊血培养基和麦康凯培养基,并继续观察菌落生长情况。

表1 分离菌株的背景来源

1.3 PCR 方法鉴定多杀性巴氏杆菌及其荚膜血清型 使用煮沸裂解的传统方法来提取分离菌株中的DNA 模板,再根据Townsend[3]描述的试验方法来鉴定分离菌株,先用kmt 引物对分离菌株进行鉴定,再capA 特异性引物鉴定分离菌株的血清型,从而得出分离菌株的荚膜血清型。

1.4 MLST 分析 根据est、pmi、adk、pgi、mdh、gdh、zwf 这7 个多杀性巴氏杆菌的管家基因对分离菌株进行PCR[4]。将PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳进一步鉴定后,将其送往南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序。得到分离菌株所对应的等位基因后上传至(http://pubmlst.org/pmultocida_rirdc/)以获取相关的ST。

1.5 药敏试验 采用Kirby-Bauer 药敏纸片的方法,选取头孢曲松、氟苯尼考、美洛西林、多粘菌素B、多西环素、新霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素、庆大霉素、复方新诺明、链霉素、诺氟沙星、左氧氟沙星、环丙沙星和妥布霉素这15 种药敏纸片,在无菌条件下,挑取纯化后的菌株,在绵羊血琼脂培养基上划线涂布均匀后,取药敏纸片均匀分布贴于琼脂面上,在37 ℃培养箱内培养24 h 后观察细菌生长状况,并且直接测量药物的抑菌圈直径。

2 结果

2.1 细菌分离 分离所得的12 株细菌在绵羊血琼脂上生长良好,呈露珠样无色透明湿润的针尖大小的菌落。12 株菌株在麦康凯培养基上均不生长。

2.2 PCR 方法鉴定多杀性巴氏杆菌及其荚膜血清型 分离菌株用kmt 引物进行PCR,将产物经过电泳后出现约为500 bp 的条带(图1),从而进一步确定分离所得菌株为多杀性巴氏杆菌。利用capA 的PCR 引物,对其进行PCR,将产物经电泳后出现约为1 000 bp 的条带(图2),因此确定分离株为荚膜血清A 型的多杀性巴氏杆菌。

图1 kmt 基因PCR 检测结果

2.3 MLST 分析 根据adk、est、pmi、zwf、mdh、gdh、pgi 这7 个多杀性巴氏杆菌的管家基因对分离菌株进行PCR,经琼脂糖凝胶电泳后分别均出现570 bp、641 bp、739 bp、614 bp、620 bp、702 bp、784 bp 这7条目的条带(图3)。测序结果12 株细菌adk 均为21,est 均为33,pmi 均为26,zwf 均为2,mdh 均为17,gdh 均为20,pgi 均为20。因此,12 株分离株的序列型均为ST-129。

图2 荚膜血清型PCR 检测结果

图3 MLST 7 个基因PCR 产物电泳结果

2.4 药敏试验 药敏结果显示,对于不同的抗生素分离菌的敏感性不同,12 株多杀性巴氏杆菌的耐药率分别是:强力霉素(58.3%)、卡那霉素(50%)、环丙沙星(25%)、链霉素(41.7%)、诺氟沙星(25%)、新霉素(33.3%)、复方新诺明(25%)、庆大霉素(8.3%)、左氧氟沙星(8.3%)、美洛西林(8.3%)、菌必治(8.3%)、妥布霉素(8.3%),而对丁胺卡那霉素、氟苯尼考、多粘菌素B 均敏感。

3 讨论

3.1 多杀性巴氏杆菌的分离鉴定 从临床送检的12 份病料中分离出细菌,经PCR 鉴定12 株分离菌都是荚膜血清型A 型的多杀性巴氏杆菌,其序列型皆为ST-129。多杀性巴氏杆菌是动物临床上危害较大的病原微生物,其宿主广泛,多种家畜与禽类甚至一部分野生动物都可感染,并且感染后可引起多种的疾病和临床表现。我国禽源多杀性巴氏杆菌的荚膜血清型以A 型为主,且在江苏地区流行株序列型为ST-129,多杀性巴氏杆菌的血清型、序列与其致病性存在一定的联系,因此在临床上建立多杀性巴氏杆菌分离株的快速分型鉴定对了解其致病规律和感染具有重要的意义[5-7]。多杀性巴氏杆菌常使鸡、鸭等禽类爆发禽霍乱,给我国的禽类养殖市场带来了巨大的损失和隐患,针对江苏及周边地区流行菌株的基因型单一性现象,使用全价细菌灭活菌苗对于该病的预防可能有较好的作用。

3.2 多杀性巴氏杆菌的药物治疗 12 株分离菌药敏结果显示,该菌对强力霉素和卡那霉素有较强的耐药性,但不同来源的分离菌株所产生的耐药性不同。其中12 株多杀性巴氏杆菌仅有两株对强力霉素敏感,其余10 株均产生不同程度耐药性。强力霉素抗菌谱广,且药物口服后吸收作用快,在体内维持时间长,禽类养殖中经常使用该药用以治疗和预防疾病。该药的滥用是临床上分离菌株产生耐药性的主要原因。有关研究表明,不同地区的多杀性巴氏杆菌其耐药性具有一定的地域差异性[8]。为了降低耐药菌株的产生,临床要科学合理的使用抗生素,使用时要考虑抗生素的质量、剂量、疗程和使用方法,以减少耐药性的产生。