一例H9亚型禽流感的诊断

楚遵锋

（山东省动物疫病预防与控制中心 250022）

禽流感（Avian influenza，AI）是由禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）引起的一种严重危害禽类健康的传染病，根据致病力可分为高致病力和低致病力，其中高致病性禽流感是危害禽类养殖的重要疫病之一，OIE 列为必须报告的疫病，我国将其列为一类动物疫病，主要是H5亚型禽流感和部分H7亚型禽流感，目前，我国主要采用强制免疫的策略结合生物安全措施进行综合防控，而H9亚型禽流感因其致病力较弱，列为低致病力禽流感。

1 材料

1.1 样品

从山东省某一肉鸡场，采集病死鸡的气管、肺脏样品4 份。

1.2 试剂

病毒核酸提取试剂盒，由苏州天隆生物科技有限公司提供；禽流感病毒荧光RT-PCR 检测试剂盒，凯杰生物工程（深圳）有限公司提供；鸡传染性支气管炎病毒荧光RT-PCR 检测试剂盒，北京生科尚仪科技有限公司提供；新城疫病毒荧光RT-PCR 检测试剂盒；流感病毒H9亚型荧光RT-PCR 检测试剂盒、流感病毒H7亚型荧光RT-PCR 检测试剂盒、流感病毒H5亚型荧光RT-PCR 检测试剂盒由江苏硕世生物科技股份有限公司提供。

1.3 主要仪器设备

NP968 天隆核酸提取仪，Roche Lightcycler 480 荧光定量PCR 仪。

1.4 方法

1.4.1 样品处理

取病死鸡的气管、肾脏样品，研磨，用pH7.2 PBS 液配制成体积比 1:5 的混悬液，冻融 3 次，8000rpm 离心 5min，取上清备用。

1.4.2 核酸提取

将处理好的组织混悬液上清取200μL，加入核酸提取试剂盒的第一列，并加入20μL 蛋白酶K 孵育，用核酸提取仪进行核酸提取，最后溶解核酸100μL，备用。

2 方法与结果

2.1 方法

2.1.1 病原定性检测

用通用型禽流感病毒荧光PCR、新城疫病毒荧光PCR 以及传染性支气管炎病毒荧光PCR 进行病原检测：取0.1mL PCR八连管，每一个管中加入 15μL RT-PCR 反应液，0.25μL RTPCR 酶，0.25μL Taq 酶，然后加入 10μL 病毒核酸，同时作阴性、阳性对照。将加好反应液的PCR 管放入荧光定量PCR 仪中，进行反应：42℃30min，92℃3min，5 个循环：92℃10sec，45℃30sec，72℃1min，40 个循环：92℃10sec，60℃30sec。最后一步收集荧光，荧光信号收集设定为Fam 荧光素。

2.1.2 禽流感病原定型检测

流感病毒H9亚型荧光RT-PCR 检测试剂盒、流感病毒H7亚型荧光RT-PCR 检测试剂盒、流感病毒H5亚型荧光RT-PCR检测试剂盒进行定型检测：采用取0.1ml PCR 八连管，每一个管中加入 7.5μL RT-PCR 反应液，5μL RT-PCR 酶，流感病毒分型反应液 4μL，去 RNA 酶水 3.5μL，然后加入 5μL 病毒核酸，同时作阴性、阳性对照。将加好反应液的PCR 管放入荧光定量 PCR 仪中，进行反应：50℃30min，95℃5min，45 个循环：95℃10sec，55℃40sec。最后一步收集荧光，荧光信号收集设定为Fam 荧光素。

2.2 结果

2.2.1 病原定性检测

通过荧光RT-PCR 检测，送检的4 份样品，鸡传染性支气管炎病毒、新城疫病毒均没有cp 值，判定为阴性，4 份样品禽流感病毒 cp 值在 10.10～11.37，判定为阳性，见表1、图1。

2.2.2 禽流感病原定型检测

通过流感病毒H9亚型核酸检测试剂盒、流感病毒H7亚型核酸检测试剂盒、流感病毒H5亚型核酸检测试剂盒、进行分型检测，H5、H7亚型流感检测结果均为阴性，H9亚型流感病毒核酸检测 cp 值 20.187～25.561 判定为阳性，见表2、图2。

图1 禽流感、新城疫、传染性支气管炎病原检测

图2 H5、H7、H9 亚型禽流感病毒分型检测

3 结论与讨论

通过流行病学调查分析、剖检、实验室检测，确诊引起该养禽场发病的主要病因为H9亚型流感病毒。H9亚型流感病毒虽然对禽类的致病率较低，但可以引起产蛋减少，造成免疫抑制，在普遍存在感染的情况下，可以造成复合感染，对养禽业造成的经济损失相当严重，而且低致病力禽流感引起养殖户的重视程度远不如高致病性禽流感，对于防疫、生物安全措施的应对措施也相对较差，一旦在禽群中存在，将会造成严重的损失。

表1 病原定性检测结果

表2 禽流感病毒核酸定型检测