检测口蹄疫病毒样颗粒疫苗对机体免疫机制的影响

刘亚欣 曲宏博 项 祎

（河北农业大学动物医学院，河北农业大学创新免疫实验，河北 保定 071000）

口蹄疫（foot- -and- mouth disease，FMD），又称口疮热，是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的偶蹄类动物共思的急性、热性、接触性传染病，也是人畜共患的传染病。主要感染牛、猪、羊、骆驼等家畜及野生的偶蹄类动物。[2]在过去的几百年里，FMD弱毒疫苗和灭活疫苗在预防和控制FMD的过程中发挥着重要作用，但同时也存在疫苗株毒力返强，病毒逃逸或灭活不彻底等危险。

病毒必须进入宿主细胞，到达细胞内的特定区域才能启动并完成自我复制，通常 DNA 病毒需要进入细胞核，而RNA 病毒需要到达细胞核周的区域。[3]新型疫苗的研究过程中发现病毒与宿主细胞的相互作用是复杂的，其中，FMDV编码的L pro在抗宿主先天性免疫方面发挥着重要作用，包括转录水平和翻译水平。L pro通过切割宿主的eIF4G，关闭宿主帽子依赖的翻译，影响细胞因子的翻译和主要组织相容性复合体的表达，在机体产生抗病毒反应之前，快速利用宿主的原料合成出大量的子代病毒。[4]

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 淋巴细胞增殖实验

RPMI-1640完全细胞培养基购自上海冠导生物工程有限公司。CCK-8试剂盒购自大连美仑生物技术有限公司。三蒸水，75%酒精，1.8%生理盐水均由本实验室配制保存。PBS购自上海联迈生物工程有限公司。ConA购自 Sigma-Aldrich公司。

1.1.2 ELISA

动物干扰素（IFN-γ）ELISA试剂盒购自上海晶抗生物工程有限公司。

1.2 淋巴细胞增殖试验

于超净台内将清洁级小鼠颈椎脱臼处死，75%酒精浸泡5分钟，用纱布吸干小鼠体表的酒精，严格按照无菌操作的要求。

在小鼠左腹侧中部剪开小口取出脾脏。用生理盐水漂洗一次， 放于含有3mL RPM1-1640完全细胞培养基的平皿。在脾两端剪一小口，将淋巴细胞吹出来，直至脾发白。收集平皿中的细胞液至4mL离心管中，离心2000r/min，5 min，弃上清。加入1mL三蒸水30-40s左右裂解红细胞，再用等量1.8%生理盐水调至等渗，离心2000r/min，5min，弃上清。最后将沉淀细胞用100μIRPMI-1640完全细胞培养基重悬，取20μl进行细胞计数，并且用等量台盼蓝检测活性细胞百分比（活细胞数大于97%）。将剩下的细胞悬液用细胞培养基调整成2.5×106/mL的脾细胞悬液，从配好的悬液里取400μl到1.5mL离心管中，加入3.2μL的ConA，分4个孔，每孔100μL； 再取400μL悬液到1.5mL离心管中，加入3.2μL的完全细胞培养液，将细胞悬夜加入96孔细胞培养板中，置37"C， 5%CO2培养箱中培养3天，每天摇动。培养结束前4h，于培养板中加入1μg/μl CCK-8液，10μL/孔， 继续培养至所需时，用读板机在波长450 nm处测定A值。

1.3 ELASA试验

（1）使用前，将所有试剂充分混匀，避免产生泡沫。

（2）确定所需的板条数目。样本（含标准品）和空白都应做复孔。

（3）加样：在标准品孔中加入100μl稀释后的Cytokine standard （细胞因子标准） ，在样本孔中加入100μl样品，在空白对照孔中加入100μl Dilution bufferR（1 x） （稀释液R ）。

（4）加检测抗体：每孔加入50μl Biotinylated antibody （生物素基化的抗体）工作液。混匀后，盖上封板膜，37℃温育90分钟。

（5）洗板：扣去孔内液体，每孔加入300μl 1xWashing buffer（洗涤缓冲液）工作液。停留1分钟后弃去孔内液体。重复4次，每一次在滤纸上扣干。

（6）加酶： 每孔加入100μl Streptavidin-HRP （链霉亲和素）工作液。盖上封板膜，37℃温育30分钟。

（7）洗板：重复步骤5。

（8）显色：每孔加入100μl TMB （过氧化酶的新底物），37 °C避光温育5-30分钟，根据孔内颜色的深浅（深蓝色）来判定终止反应。通常显色10-20分钟可以达到很好的效果。

（9）终止反应：每孔迅速加入100μl Stop solution （停止液）终止反应。

（10）读板：终止后10分钟内，用检测波长450 nm读值。

1 2 3 4 5 6 7 5 9 10 11 12 A 0.704 O.672 0.627 0.626 0.593 0.652 0.615 0.649 0.625 0.666 1.063 O.654 B 0.655 0.514 0.716 0.629 0.046 0.046 0.245 0.544 0.045 0.046 0.216 0.655 C 0.716 0.652 0.642 0.714 0.045 0.046 0.235 0.519 0.047 0.047 0.047 0.750 D 0.699 0.515 0.359 0.356 0.046 0.045 0.237 0.475 0.046 0.045 0.046 0.745 E 0.599 0.510 0.252 0.259 0.047 0.045 0.235 0.443 0.046 0.047 0.201 0.705 F 0.673 0.232 0.530 0.654 0.046 0.047 0.225 0.539 0.047 0.047 0.050 0.543 G 0.653 0.444 0.446 0.569 0.046 0.046 0.245 0.459 0.046 0.046 0.045 0.624 H 0.923 0.655 0.772 0.705 0.732 0.705 0.725 0.716 0.716 0.733 0.955 0.769

2 结果

2.1 鉴定口蹄疫病毒样颗粒疫苗能诱导小鼠淋巴细胞增殖

实验显示未加人刺激物培养的对照组中除少量自增殖外，没有发生明显的增殖改变。而加人ConA共同培养的刺激组细胞则发生了显著的增殖，实验组随着浓度的增加吸光度A值增大，这个结果说明了这个生长因子具有促进细胞增殖的作用。

2.2 口蹄疫样颗粒刺激小鼠产生更多的外周血细胞因子

为了验证病毒样颗粒如何刺激小鼠产生更多的外周血细胞因子，在每个标准品孔加入100 μl稀释后的Cytokine standard （细胞因子标准） ，每个样品孔加入100 μl样本，每个空白对照孔加入100 μl Dilution bufferR（1 x） （稀释液R ）。加生物素基化的抗体、链霉亲和素后，实验显示外周血细胞因子增多。

对照组实验组

3 讨论

口蹄疫的多血清型及型间无交叉保护，为口蹄疫的控制带来巨大困难。在新型疫苗进入实际应用前，还需对此类疫苗的免疫机制和分子生物学特性作更深入地研究。[5]已有研究表明口蹄疫病毒样颗粒疫苗能够增强机体的免疫能力，抑制FMDV VLPs在机体内的生长繁殖。那么阐明口蹄疫病毒样颗粒疫苗对机体免疫机制的增强作用，则有利于对FMD进行有效的防控提供科学依据。本文首先验证出，口蹄疫病毒样颗粒疫苗能刺激淋巴细胞分化，之后通过ELIS A实验得出该疫苗能剌激机体产生更多的外周血细胞因子，从而调节固有免疫和适应性免疫。

4 结论

口蹄疫病毒样颗粒疫苗能刺激机体淋巴细胞分化，同时使机体产生更多的记忆细胞，分泌更多IFN-γ。由此可知，口蹄疫病毒样颗粒疫苗能够通过刺激淋巴细胞分化来增强机体免疫应答功能，并且使机体产生更多的记忆细胞来应对FMDV VLPs二次感染机体，同时使机体分泌更多IFN-γ以抑制FMDV VLPs在机体内的生长繁殖。