SIRT1与肝细胞癌病理及预后的研究进展及靶向治疗展望

林治华，王俊伟,邓雅庭,李 静,王 娟

(1.重庆理工大学 药学与生物工程学院, 重庆 400054; 2.靶向药物筛选与活性评价重庆市高校重点实验室， 重庆 400054; 3.重庆大学 化学化工学院, 重庆 400044)

肝细胞癌(HCC)为全球第五大常见恶性肿瘤，2016年，全球1 090万例癌症新增病例中，肝癌就有78.2万例[1]。中国肝癌的患病、死亡率占亚洲近70%。在过去几十年中，HCC的诊断和治疗已经取得了较大发展。然而，HCC仍然与高死亡率相关，即使治疗被认为具有潜在治愈性，该肿瘤的预后还是很差[2]。此外，调控HCC发展和进展的分子变化和机制尚不清楚。肝病尤其是肝癌由于早期症状不明显所以不易被人发现，在诊断出时癌细胞已大多发展到中晚期，错过了良好的治疗时机。因此，HCC在目前的治疗手段主要是以手术结合放化疗为主，预后效果很差，死亡率也极高。人们通常认为CD8+T细胞在抗肿瘤免疫应答中起重要作用，并且耗尽的CD8+T细胞有助于肝细胞癌(HCC)进展。NK细胞是肝脏中主要的淋巴细胞亚群和防御感染肿瘤的第1道防线，对其在HCC患者肿瘤进展中的特殊作用已有深入研究。NKG2A在NK细胞和NKG2A配体HLA-E在瘤内肝癌组织中的表达增加。这些NK细胞，尤其是CD56dimNK细胞，NKG2A表达较高，表现为功能衰竭，预后较差[3]。因此，探求出新的HCC诊断标识物和治疗靶点是当前研究的热点。

沉默信息调节因子2同系物1(SIRT1)是一种依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的去乙酰化酶，它在正常的胚胎发育、分化及维持自身平衡中是不可或缺的。SIRT1在从酵母到人类的进化过程中，是细胞代谢、长寿、衰老、凋亡、分化、应激反应、能量代谢之间的关键环节。SIRT1在细胞存活中的作用是通过关键细胞周期分子和凋亡调节蛋白[4](包括Foxo家族蛋白、Ku70、NF-Κb和p53)的脱乙酰化来实现的。

近年来，大量文献表明，SIRT1在肿瘤发生和发展中起着重要的作用[5-10]，因此SIRT1与肿瘤之间的关系也成为了肿瘤研究领域的一个热点。

1 SIRT1与肿瘤的发生发展

大量研究表明，在许多肿瘤组织中SIRT1的表达水平显著增加，如白血病[5]、皮肤癌[6]、前列腺癌[7]、大肠癌[8]，并且其在控制细胞衰老和衰老中的功能可能与肿瘤发展和肿瘤细胞对SIRT1过表达的依赖性有关。SIRT1在肿瘤发生发展中有着两种截然不同的作用：一方面，作为促进细胞存活的基因，SIRT1可能具有致癌功能。例如，SIRT1脱乙酰化和下调p53，这可以延长细胞类型如神经元和肌肉细胞的寿命，但是在具有分裂细胞的组织中会引起癌症[9]。另一方面，作为促进生物存活的基因，SIRT1可能有肿瘤抑制功能[10]，这些在研究中一直存在争议。如今，一些SIRT1抑制剂也被学者用于肿瘤相关研究，如表1所示。值得一提的是，仅仅只有3-TYP这种SIRT1抑制剂针对的肿瘤是肝细胞癌，并且该抑制剂还是SIRT3抑制剂，特异性不够强。研究者发现 SIRT1 在HCC组织及HCC系中的表达异常，增高数倍，SIRT1 的基因沉默可以显著抑制HCC的生长并诱导其老化，这与SIRT1 在维持HCC的增殖及端粒末端的稳定性上具有重要作用有关[3]，此外，SIRT1已被报道在HCC中起肿瘤启动子的作用[11]，提示了SIRT1可能作为肝癌的一个新的标识物以及治疗靶点。

表1 SIRT1抑制剂

拮抗剂名称结构式针对肿瘤类型CAS号IC50值Sirtinol乳腺癌(MCF-7)、肺癌(H1299)410536-97-948 μm(In Vitro)EX 527肺癌(NCI-H460)、骨髓瘤(U-2 OS)、乳腺癌(MCF-7)49843-98-338 nM(In Vitro)Salermide白血病(MOLT4)、乳腺癌(MDA-MB-231)、结肠癌(SW480)1105698-15-4100 μm(In Vitro)Tenovin-6乳腺癌(MCF-7)1011557-82-621 μm(In Vitro)3-TYP肝癌(HepG2)120241-79-488 nM(In Vitro)

2 SIRT1在肝细胞癌中的临床病理意义及预后

Jiang等[11]的研究表明，SIRT1是HCC的致癌蛋白，并且是肝癌手术切除后恶化结果的预测因子。他们的研究结果表明：SIRT1在HCC中过表达，发现SIRT1表达升高与肝癌患者预后不良相关。SIRT1的去乙酰化酶活性是肝细胞癌中SIRT1致癌作用的关键。当SIRT1的去乙酰化区域发生突变时，HCC细胞增殖和集落形成受到抑制[12]。例如，SIRT1可以使LC3去乙酰化，在HepG2细胞中诱导自噬[13]。此外，p53是SIRT1研究最广泛的靶点，SIRT1可以抑制细胞衰老和凋亡，从而刺激HCC中的肿瘤发生[14]。失活的SIRT1 (Ser 47上无磷酸化)可与突变的p53结合，从而激活AMPK/mTOR通路，在HCC中发挥致癌作用。Jiang等[11]的临床病理分析显示，SIRT1的表达增加与高表达的p53在HCC中相关(OR(odds ratio)=2.71,95%CI(confidence interval):1.39-5.29,P=0.003)。乙型肝炎病毒(HBV)是引起HCC的主要原因之一,SIRT1在hbv感染细胞中上调，其转录和复制可以在HCC中上调[15]。在他们的临床病理分析中可以发现：SIRT1表达增加在hbv感染的HCC中更为常见(OR=1.63,95%CI:1.04-2.57,P=0.03)。到目前为止，没有有效的治疗可用于HCC。基于SIRT1在癌细胞生长和存活中的功能作用，阻断SIRT1活性可能有益于HCC患者，所以应进一步研究以检测这些抑制剂对HCC的影响。

3 SIRT1与c-Myc协同治疗HCC的进展及预后

c-Myc基因是Myc基因家族的重要成员之一，具有可易位、调节多种物质、无限增殖、促进细胞分裂等作用，c-Myc基因参于细胞凋亡并且与多种肿瘤发生发展有关。

SIRT1在肿瘤发生中的作用在SIRT1和致癌c-Myc之间的关联是有争议的。最近，有报道称c-Myc与SIRT1在肿瘤发生中呈正相关[16]。在结直肠癌中，c-Myc增加了SIRT1蛋白水平和SIRT1的脱乙酰酶活性[16]。此外，SIRT1还增加了c-Myc的转录活性并在成纤维细胞中稳定[16]。SIRT1介导的c-Myc脱乙酰基增加了c-Myc的半衰期，并促进了c-Myc/Max关联，从而抑制细胞衰老和抑制凋亡[16]。相反，早期的一份研究报告显示，尽管c-Myc转录增加，SIRT1通过脱乙酰作用使c-Myc去稳定化，因此表明SIRT1是Myc靶向性肿瘤发生的负调控因子[17]。在Yuan等[16]的研究中，证明SIRT1和c-Myc的表达呈正相关，并且均促进肿瘤细胞的增殖。在Tet-O-MYC细胞中诱导的c-Myc表达导致SIRT1相应增加了表达，并且SIRT1的过表达也导致增加c-Myc表达。相反，致癌性c-Myc沉默导致SIRT1表达显著且紧密。有趣的是，致癌c-Myc再激活导致SIRT1表达的迅速逆转。人类HCC细胞系中SIRT1调节的生物学效应与在小鼠Tet-O-MYC细胞中观察到的相同。此外，人类HCC中的SIRT1表达与c-Myc和Ki67的表达显著相关。这些发现一起支持SIRT1和MYC在小鼠和人类肝细胞增殖和存活中的表达一致的作用。当考虑c-Myc作为有效的致癌基因的作用时，这些结果表明SIRT1可以被认为是c-Myc在肝脏肿瘤发生中的重要靶标。

根据c-Myc和SIRT1在Tet-O-MYC肝癌细胞中表达的正相关性[18]，Kim等[19]检测到人类HCC中SIRT1和c-Myc之间存在显著的免疫组化关系。此外，Sirt 1和c-Myc的表达预示HCC患者的OS(overall survival，总生存)和DFS(disease-free survival，无病生存期)更短。这些发现一起表明SIRT1似乎在肝脏肿瘤发生中具有重要作用。此外，c-Myc的表达与HCC患者已确定的不良临床病理特征(包括低血清白蛋白和晚期临床分期)显著相关。此外，当Yuan等[16]分析c-Myc和SIRT1对HCC患者的预后影响时，表达c-Myc和SIRT1的患者与不表达c-Myc和SIRT1的患者(平均总生存时间分别为48.456 7、115.086 7个月)相比显示出更短的OS和DFS。因此，这些数据表明 c-Myc和SIRT1在肝肿瘤发生中以及c-Myc和SIRT1在肝脏肿瘤发生中的独立作用之间存在相关性。类似于上述结果，先前已报道c-Myc表达与HCC的进展和不良预后相关[20]。然而，目前还不清楚SIRT1是否是HCC的真正预后指标。最近的一篇报道提出SIRT1可能是HCC的预后指标[16]，但其他报道无法发现SIRT1的预后意义。

值得注意的是，SIRT1表达也与HBV感染显著相关。SIRT1通过其在HBV感染中诱导的组蛋白脱乙酰酶的活性也有助于肝脏肿瘤发生发展。为了进一步确定SIRT1准确的肿瘤促进机制，有必要进一步研究。

总之，这些研究结果表明：SIRT1与c-Myc在肝癌发生中协同作用，可能是调节肝癌的重要分子靶点。正如其他研究[21]发现抑制SIRT1可能是预防高危患者肿瘤发展的有效策略，或作为已建立肿瘤的治疗策略。总之，研究结果表明SIRT1和c-Myc可能参与HCC的进展，并且这两种分子都可以用作总体HCC预后的临床指标。

4 SIRT1在肝细胞癌中与P53之间的关系

人体抑癌基因p53的失活对肿瘤形成起重要作用，其野生型使癌细胞凋亡，从而防止癌变，而突变型则会促进癌变。p53肿瘤抑制基因是人类肿瘤中突变最频繁的基因。

SIRT1在肿瘤发生发展中的作用存在争议，以前的研究表明：SIRT1的功能取决于肿瘤发生的阶段并且可能是肿瘤类型特异性的。在Zhang等[12]的研究中，他们通过体外、体内和19项临床研究证明了SIRT1、AMPK和p53在HCC中的重要作用。其数据表明SIRT1的作用取决于HCC细胞和肿瘤的p53突变状态，这支持对HCC患者的预后和治疗评估中的生物标志物评估的需求。通常认为SIRT1会破坏细胞周期控制，并通过p53脱乙酰化和失活促进肿瘤发展，表明p53是SIRT1和SIRT1致癌活性之间的重要中间体[22]。 最近，有报道表明AMPK和SIRT1之间通过细胞NAD +动态水平相互作用[23]。

Ganesan等[24]推测SIRT1是诱导AMPK磷酸化和抑制mTOR通路所必需的，事实上，shRNA对SIRT1的抑制通过突变型p53细胞PLC5-sh SIRT1中的磷酸化AMPK降低激活了mTOR(Ser2448)的磷酸化[12]。

个别SIRT1靶标的重要性可能取决于所研究的细胞过程和细胞类型[25]。然而已经表明磷酸化SIRT1可以通过直接与必需因子(即mTOR)相互作用来调节细胞存活[26]。在这种情况下，Zhang等[12]的研究结果表明：磷酸化SIRT1(Ser47)仍然对突变p53 HCC中的应激诱导的激活有响应。此外，磷酸化SIRT1可通过某种肿瘤抑制途径抑制HCC生长。

5 SIRT1在HCC细胞自噬中的作用

自噬是将自身的细胞质蛋白或细胞器吞噬并包裹成囊泡的过程，从而实现细胞自身的代谢需要。在肿瘤研究中其作用尚未研究透彻。

保护性自噬已被证明是癌细胞化疗耐药的潜在机制[27]。Xiong等[28]研究表明：HULC(highly upregulated in liver cancer)引发的保护性自噬减弱了HCC细胞对化学治疗剂的敏感性。另外，他们发现HULC通过上调SIRT1蛋白引起自噬。众所周知，SIRT1通过调控Atg5、Atg7、Atg8、Beclin I、FoxO1、p53等许多重要的自噬组分诱导自噬[29]。他们的结果显示HULC通过增强SIRT1介导的Atg5和Atg7的脱乙酰化来促进HCC细胞的自噬。此外，以前的报道将SIRT1在HCC中的高表达归因于其翻译后调节，因为SIRT1 mRNA在HCC和相邻非癌组织之间没有显著差异[5]。Xiong等[28]首次证实HULC的上调至少部分是由于HCC中SIRT1蛋白的升高。随后，USP22被鉴定为参与HULC介导的SIRT1诱导。同时，需要注意的是，在HULC过表达之后，MDM2(mdm2癌基因在多种肿瘤中发现其发生突变与扩增转移，而且mdm2突变与p53突变不共存)似乎略微减少。最近，据报道，MDM2增强了SIRT1的泛素化并促进其在DNA损伤诱导的细胞死亡过程中的降解[30]，这可能提供了HULC调控SIRT1除USP22以外的另一种手段。当然，它需要进一步的研究来阐明MDM2是否参与HULC介导的SIRT1诱导。

USP22是去泛素化酶(DUBs)的成员，可以催化去除靶蛋白中的泛素。USP22参与NAD+依赖性蛋白脱乙酰酶SIRT1[31]，以及组蛋白H2A和H2B的去泛素化[32]。最近，有证据表明，USP22参与了包括HCC在内的多种癌症预后不良相关的癌发生[33]。在Xiong等[28]的研究中，证明了lncRNA HULC可以显著上调USP22的蛋白质水平，并且USP22在介导HULC诱导的去泛素化和稳定SIRT1在HCC细胞中具有关键作用。然而，在之前的报道显示，USP22在调节SIRT1蛋白中发挥不同的作用。这些研究之间的差异可能归因于各种细胞的背景或对细胞的不同刺激因素。此外，他们筛选出3种新型miRNA(miR-6825-5p、miR-6845-5p和miR-6886-3p)，并证明它们可以直接靶向USP22 3’-UTR。有趣的是，他们发现miR-6886-3p抑制USP22表达，尽管该miRNA未预测靶向USP22 3’-UTR。据报道，在miRNA的5’末端称为“种子区域”的6到8nt(核苷酸酶)长的片段，并引发靶向mRNA反应(促进mRNA降解或抑制mRNA翻译)[34]。然而，越来越多的证据表明，存在与miRNA种子序列不完全互补但仍能有效抑制基因表达的“非规范”位点，并且约占种子序列相互作用的60%[35]。因此，miR-6886-3p抑制USP22表达应该在HCC细胞中以非规范的方式进行。

HULC降低了3种miRNA(miR-6825-5p、miR-6845-5p和miR-6886-3p)的表达和活性[28]，提高了USP22蛋白质水平，增强了去泛素化SIRT1并稳定它，最终引发HCC细胞的自噬。此外，HULC/SIRT1/自噬途径在化疗药物存在下被激活，通路的干扰增强了HCC细胞的化疗敏感性。总之，这些发现说明了HULC的一个新功能，“HULC/USP22/SIRT1 /保护性自噬”途径可能成为开发HCC化疗敏感策略的新靶点。

6 展望

随着研究的深入，虽然有少数研究证明SIRT1在HCC的演变发展中起着抑制的作用，但是更多的研究表示，SIRT1促进了HCC的演变，这些观察结果促使研究人员假设健康肝脏组织中的SIRT1活性可以抑制肿瘤的发生，然而在转化后，SIRT1表达或其过表达可能为肿瘤细胞提供保护或存活优势。抑制SIRT1会损害动物模型中的肿瘤细胞生长，并且可能使用小分子抑制剂在体外和体内实现抗肿瘤作用，并共同表明SIRT1可能是一种新型治疗癌症的靶标。本实验室丁雪垒等[36]的研究中，采用sybyl2.0药物虚拟筛选软件，选取 33个噻吩并[3，2-d]嘧啶-6-甲酰胺类SIRT1-3抑制剂，进行三维定量构效关系(3D-QSAR)研究，为筛选高活性 SIRT1-3抑制剂的研究奠定基础。抑制SIRT1的表达可能会有效地抑制肝癌的发生发展。SIRT1是否作为致癌基因或肿瘤抑制因子尚不清楚，但这些发现提供了有力的论据：SIRT1可能是肿瘤发展的关键调节器。SIRT1 的生物学功能多样，且极为关键和重要，与人类的多种肿瘤也密切相关。然而，SIRT1 在HCC中自噬的作用还需要更深入的研究，SIRT1表达与性别、HBV感染、TNM分期、AFP水平、p53表达和肿瘤大小有关，但研究都不够深入，在本实验室丁雪垒[37]的研究中，选取SIRT1蛋白与尼克酰胺、EX527,在基于SIRT1受体下，通过高通量虚拟筛选以及分子模拟筛选并且合成出化合物T，通过CCK-8增殖抑制试验、Annexin V-FITC/PI双染，流式细胞仪检测、Western blot法、裸鼠模型等方法，得出该化合物对肝细胞癌HepG2有特异性的抑制作用。本实验室的刘蒙蒙[38]在此基础上，将HepG2细胞中的SIRT1进行敲除，采用CCK-8 增殖抑制法检测化合物T对HepG2及其敲除细胞的增殖抑制率，得出化合物T对SIRT1敲除细胞均有一定的增殖抑制作用，所以小分子化合物T有望作为抗肿瘤药物，特别是抗HCC的靶向药物。尽管如此，关于SIRT1靶点针对肝细胞癌的抑制剂研究也不够深入，如果以此作为切入点，对肝细胞癌的临床研究与治疗将会有一个很大的进展。总之，SIRT1表达可能作为HCC潜在的治疗靶点和预后指标，为以后的研究提供了方向和路线。