霍乱弧菌检测技术的研究进展

王国臻 王玉格 王宪钰 马丽 王彬 李天园

【摘 要】霍乱是由霍乱弧菌所引起的烈性肠道传染病，其传播速度极快，发病急，属于国际检疫传染病，其被我国列为甲类传染病。霍乱的快速检测显得极其重要，现在国内外有很多检测霍乱弧菌的方法。主要是传统的检测方法及分子生物学和免疫学的方法，本文主要对近几年最新的霍乱弧菌检测技术的研究进展进行综述。

【关键词】霍乱弧菌；检测技术；分子生物学；免疫学

霍乱是一种烈性肠道传染病，霍乱的病原体—霍乱弧菌（Vibrio cholerae）经人工培养呈杆状或弯曲弧状，有鞭毛能运动的革兰阴性菌。霍乱弧菌由于O抗原的不同，被分为155个血清群，主要是O1群和O139群可导致霍乱的发生，其他血清型尚未发现可致霍乱，O1群和O139群主要引起感染者剧烈呕吐，腹泻，失水，肌肉痉挛甚至死亡。所以霍乱弧菌的快速检测显得极其重要。国内外学者建立了大量应用广泛的检测技术。其中传统的细菌培养，生化检测以及血清学检测等作为常规的检测方法被应用。近来，分子生物学，免疫学和俩者结合的技术越来越成熟，以其快速简便，准确性高，特异性极强等优点被广泛应用。

1.霍乱弧菌的致病机理及流行情况

产生霍乱毒素的霍乱弧菌为产毒株，其主要致病毒素是霍乱肠毒素，霍乱弧菌的致病物质与其染色体上的多个基因有关，主要致病因子有三个，a.CTX基因原件，b.TCP致病性岛，c.ToxR，霍乱肠毒素是由A亚单位和B亚单位构成的一个多聚体蛋白，当人或动物感染后，B亚单位可与攻击对象的小肠黏膜上皮细胞上的受体结合，然后A亚单位进入细胞，导致一系列酶反应发生，然后引起肠道分泌功能亢进，引起大量液体及血浆中的大量电解质进入肠腔，由于分泌功能超过肠道的重吸收能力，从而导致人体严重的腹泻，由于脱水和电解质缺失，引起循环衰竭，血压下降继而脑供血不足，然后缺氧昏迷；更甚者不发生呕吐和腹泻症状，直接进入中毒性休克而死亡。

2.检测方法

2.1传统的检测方法

霍乱弧菌兼性厌氧，营养要求简单，在碱性蛋白胨水或平板上生长良好，所形成的菌落无色透明，扁平或稍凸起，边缘整齐。现国内已有许多选择培养基，如TCBS等。其生化反应氧化酶阳性，过氧化物酶阳性，吲哚反应阳性。能发酵多种单糖，双糖，产酸产气，发酵乳糖迟缓，不分解阿拉伯糖、水杨素等。霍乱弧菌在无盐的生存环境中也可生活，其他菌则不能。

2.2分子生物学方法

2.2.1 PCR-激光诱导荧光-毛细血管电泳检测方法

此方法以毛细血管电泳法和激光诱导荧光检测器结合用以检测霍乱弧菌，此方法首先让霍乱弧菌肠毒素CTXA基因来选择引物，然后利用PCR法扩增霍乱弧菌的特异性基因片段，所得到的PCR产物，然后利用高效毛细管电泳-激光诱导荧光快速检测，此方法对毛细血管电泳法和PCR条件进行了改良，用以实现快速检测。在改良的PCR条件下，霍乱弧菌的CTXA基因有效扩增，无特异性条带；扩增产物测序发现其与基因库的序列同源性比匹配度几乎达到100%，其检测结果与普通凝胶电泳法一致。此方法优点明显，所需的检验样品少，非常快速，所建立的技术先进，可应用于科研等专业实验室。

2.2.2环介导恒温扩增技术

环介导恒温扩增技术是一项非常特殊的技术，它可以针对基因的多个区域然后设计不同的特异性引物，然后在链置换DNA聚合酶的作用下，进行恒温扩增，15到60min左右即可实现十的九次方倍的核酸扩增，目前已有人开展相关研究，这种方法应用于霍乱弧菌的檢测时，是利用霍乱弧菌外膜蛋白的ompW基因设计特异性引物，建立霍乱弧菌的环介导恒温扩增技术检测方法，同时对霍乱弧菌进行扩增，然后检测其灵敏度和特异性，此技术与普通PCR法进行比较，反应速度极快， 而且反应结果都可以通过肉眼直接观察断定，实验显示此检测办法灵敏度极高，特异度为100%。可用于食品方面的检测，与传统的检测方法比大大缩短了检测的时间，灵敏度高，其可直接用于霍乱弧菌的现场流行学检查。

2.3免疫学方法

2.3.1近红外免疫层析法

近红外免疫层析法的建立用以快速检测O1群霍乱弧菌，其借鉴近红外荧光探针的定量免疫层析试纸条，其建立的技术基础为低噪声激发式荧光标记的O1群霍乱弧菌免疫层析试纸条，利用了近红外免疫层析技术，双抗体夹心法检测O1群霍乱弧菌，然后制造靶向O1群霍乱弧菌的免疫层析的试纸条，此方法顺应了使用更高灵敏度的标记物替代胶体金颗粒的发展趋势，其检测结果快速准确，特异性强，此方法与普通胶体金方法相比较，其灵敏度提高了100倍，极大的提高检验检疫效率。

2.3.2胶体金免疫层析法

胶体金免疫层析法可对霍乱弧菌O1群和O139群进行快速检测，胶体金免疫层析法运用胶体金免疫层析技术，以双抗体夹心法检测霍乱弧菌O1群和O139群，然后对此方法进行其灵敏度，特异性等方面的对比，与细菌培养法检测多份临床标本相比较该方法能在十分钟内完成检测，此方法具有操作简便快速，灵敏度高，不需任何仪器设备、能够同时检测大量样品等优点。可用于进出口的检测。

3.结语

综上所述，分子生物学和免疫学方法对霍乱弧菌的检测都有着良好的灵敏度和特异性，能达到快速检测的目的。分子生物学方面，随着引物与探针的设计更精确，其检测技术也越来越成熟，因成本低，效率高等优点被广泛应用；免疫学方面，因操作简单，工作量大，检测快速等优点也被广泛推广。我们应该将其与分子生物学与免疫学相结合，然后再确定病原体，相信不久的将来，人们可以发现更多的方式检测霍乱弧菌，为霍乱弧菌的早期检测和临床治疗提供更多的有价值的信息。

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