骨肉瘤患者3种基因多态性与大剂量甲氨蝶呤不良反应相关性的Meta分析Δ

宋再伟，刘爽，易湛苗，张恩瑶，赵荣生，3#

（1.北京大学第三医院药剂科，北京100191；2.北京大学药学院药事管理与临床药学系，北京 100191；3.北京大学医学部药物评价中心，北京 100191）

骨肉瘤是最常见的原发性恶性骨肿瘤，好发于儿童与青少年。目前骨肉瘤治疗难度仍较高，临床上多采用以外科治疗为主、化疗或其他治疗为辅的治疗方案[1]。对于骨肉瘤的化疗方案，美国国家综合癌症网络（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）、《骨肿瘤临床实践指南》[2]、欧洲肿瘤内科学会（European Sarcoma Network Working Group，ESMO）、《骨肉瘤诊断、治疗和随访指南》[3]、《中国骨肉瘤临床循证诊疗指南（2018）》[4]均推荐了大剂量甲氨蝶呤[High-dose methotrexate（HDMTX），静脉注射，＞500 mg/m2[5]]作为一线化疗药物。在骨肉瘤化疗方案中，HD-MTX在有效提高血药浓度、改善疗效的同时，其药物不良反应发生率也相应增加，包括血液毒性、肝毒性、肾毒性和神经毒性等严重不良反应。HD-MTX不良反应存在较大的个体差异，可导致化疗中断、肿瘤复发，影响治疗，因此受到广泛关注[6]。

MTX是叶酸拮抗剂，其通过与细胞内二氢叶酸还原酶结合，竞争性地抑制二氢叶酸还原酶活性，阻断二氢叶酸转化为具有生物活性的四氢叶酸，进而发挥药理作用。在甲氨蝶呤代谢途径中，亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）、还原性叶酸载体（RFC）、P-糖蛋白（P-gp）相关的基因多态性被广泛研究[7-9]。MTHFR是细胞内叶酸代谢的关键酶，对MTX发挥药理作用有重要意义，其基因常见多态是MTHFR C677T（rs1801133）/A1298C（rs1801131）[7]。RFC1/SLC19A1是转运MTX进入细胞产生疗效的重要载体，RFC1G80A（rs1051266）存在多态性[8]。P-gp是由多重耐药基因（MDR1/ABCB1）编码的外排蛋白，将MTX外排出细胞，其基因常见多态是MDR1C3435T（rs1045642）[9]。

目前，国内外对MTHFR C677T/A1298C、RFC1G80A、MDR1C3435T多态性与HD-MTX不良反应相关性的研究结论不一致，有研究[10]表明，MTHFR677CT/TT型可显著增加中国人群的中重度口腔黏膜炎的发生风险，而比利时人群中未观察到显著相关性[11]。骨肉瘤患者中HD-MTX个体化用药仍缺乏有效指导，但尚无系统评价综合评估骨肉瘤患者中相关基因多态性对HD-MTX不良反应的影响。因此，本研究采用Meta分析的方法，系统评价MTHFR C677T/A1298C、RFC1G80A、MDR1C3435T对HD-MTX不良反应的影响，为骨肉瘤患者HD-MTX临床用药提供循证参考，为临床决策提供循证依据，促进HD-MTX个体化用药，最终改善骨肉瘤患者的临床结局。

1 资料与方法

1.1 纳入与排除标准

1.1.1 研究类型 国内外公开发表的队列研究。

1.1.2 研究对象 接受HD-MTX化疗的骨肉瘤患者，种族、性别、年龄不限。

1.1.3 暴露因素MTHFR C677T/A1298C、RFC1G80A、MDR1C3435T分别按照野生型与突变型分组。

1.1.4 结局指标 HD-MTX相关不良反应发生率，包括：①血液毒性与骨髓抑制发生率（a.白细胞减少发生率；b.粒细胞减少发生率；c.血小板减少发生率；d.血红蛋白降低/贫血发生率），②肝毒性发生率，③肾毒性发生率，④口腔黏膜炎发生率，⑤消化道毒性发生率，⑥整体不良事件发生率。不良反应分级参照世界卫生组织（WHO）抗癌药物毒副作用分级、美国国家癌症研究所（National Cancer Institute，NCI）常见不良反应评价标准（Common terminology criteria for adverse events，CTCAE）5.0版或其他通用标准，分为轻、中度（G1-2）和重度（G3-4）。

1.1.5 排除标准 重复发表的文献；样本重复的文献仅纳入最新发表的文献；联系作者后仍无法获取全文的文献；结局指标为总生存期（Overall survival，OS）等有效性指标或原发疾病患病风险；未提供基因型分布或不符合哈迪-温伯格平衡（Hardy-Weinberg equilibrium，HWE）[12]的研究；数据有误或缺失的研究。

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1.2 检索策略

计算机检索Medline、Embase、中国知网、万方数据和中国生物医学文献数据库，补充检索clinicaltrials.gov。检索限定在题目或摘要中进行。英文数据库以“Methotrexate”及其同义词，“Osteosarcoma*”“Osteogenic sarcoma*”等大剂量甲氨蝶呤适应证，“Gene”“Polymorphim”“Methylenetetrahydrofolate reductase”“RFC1”“Pglycoprotein”“Multidrug resistance protein 1”等关键词合并检索。中文数据库以“甲氨蝶呤”及其同义词，“骨肉瘤”等大剂量甲氨蝶呤适应证，“基因”“多态性”“亚甲基四氢叶酸还原酶”“还原叶酸载体”“P-糖蛋白”等关键词合并检索。检索时限均为建库起至2018年3月。同时对纳入文献的参考文献进行手工补充检索。本项系统评价与Meta分析已在PROSPERO平台（网址：http：//www.crd.york.ac.uk/PROSPERO/）注 册 ，注 册 号No.CRD42018096992。

1.3 资料提取与质量评价

1.3.1 资料提取 明确和统一文献的纳排标准后，按照题目、摘要和全文的逐级顺序，由2名研究者独立进行文献筛选。完成文献筛选后，2名研究者根据预先设计的资料提取表独立提取纳入文献的基本信息，提取信息包括第一作者、发表年份、患者国家、种族或地区、性别比例、年龄、MTX剂量、基因位点、是否符合HWE平衡（χ2检验）、结局指标及不良反应定义等。若纳入文献中相关数据缺失，通过邮件形式联系通信作者获取数据。出现不一致时，通过讨论或咨询第三方协商解决。

1.3.2 质量评价 2名研究者独立采用Cochrane协作网推荐的纽卡斯尔-渥太华量表（The Newcastle-Ottawa scale，NOS）[13]评价纳入研究的偏倚风险。NOS量表共8个评价条目，满分为9分，其中研究人群选择方面4个条目、组间可比性方面1个条目、结果测量方面3个条目。7～9分为高质量研究，5～6分为中等质量研究，1～4分为低质量研究。如有异议，由第3方（通信作者）参与讨论并解决分歧。

1.4 统计学方法

应用Microsoft Excel 2016软件建立数据库，双人录入并校对。对纳入文献的基因型分布频率进行χ2检验，P＞0.05表明样本符合HWE，说明样本具有群体代表性。

首先判断同一结局指标的研究间是否存在明显临床异质性，如纳入人群疾病种类、不良反应定义是否相似。当2项或2项以上文献报道了同一种结局指标且研究间没有明显临床异质性时，采用Cochrane协作网提供的Rev Man 5.3统计软件进行Meta分析。对于无法进行Meta分析的结局指标，进行描述性分析。Meta分析时，分析资料与方法如下：（1）统计学指标，采用比值比（Odds ratio，OR）及其95%置信区间（CI）评估基因多态性与HD-MTX不良反应的相关性；（2）遗传模型，分别计算显性遗传模型（MM/Mmvs.mm）、隐性遗传模型（MMvs.Mm/mm）、等位基因遗传模型（Mvs.m）下的OR及95%CI，其中M为突变型，m为野生型；（3）效应量检验，用Z检验计算OR是否具有统计学意义（P＜0.05）；（4）统计学模型，所有分析均采用固定效应模型合并OR值；（5）异质性评估，用q检验及I2评价研究间的异质性大小，P异质性＞0.10或I2≤50%表明不存在显著异质性，反之，P异质性≤0.10且I2＞50%表明异质性明显[14]，则进一步分析异质性来源；（6）敏感性分析，逐篇剔除纳入Meta分析的研究，观察剔除的研究对合并效应量的影响，以判断Meta分析的稳定性和可靠性；（7）亚组分析与异质性分析，当研究数量足够时，按不同年龄和种族进行亚组分析，各研究结果存在统计学异质性时，首先排除数据提取错误，观察亚组分析是否可以解释异质性来源，并结合敏感性分析寻找异质性来源，若最终无法明确异质性来源，换用随机效应模型，或行描述性分析；（8）发表偏倚，采用倒漏斗图评估发表偏倚（研究数＞10时有效[15]）。

2 结果

2.1 纳入研究基本信息

按照相应检索式进行检索，共检出文献1 901篇，手工补充纳入文献4篇，去重764篇，阅读题目和摘要后去除1 129篇，去除研究类型不符合2篇、研究人群不符合1篇、未报道结局指标数据1篇，最终纳入8篇（项）研究[10-11，16-21]，其中 4 项研究[10-11，17-18]纳入 Meta分析、4 项研究[16，19-21]仅纳入描述性分析，合计608例患者。8项纳入研究中，3 项研究[10，17，19]对象为亚洲人群，5项研究[11，16，18，20-21]对象为高加索人群，4项研究[11，16-17，21]纳入的患者为儿童，3 项研究[10，19-20]同时纳入了儿童与成人，1 项研究[18]未报道患者年龄范围。剂量方面，8项研究均严格限定为HD-MTX。基因多态性方面，研究MTHFR C677T、MTHFR A1298C、RFC1G80A、MDR1C3435T的研究数量分别为 6[10-11，17-19，21]、5[17-21]、4[16-18，21]、2[16，20]项。经过χ2检验，8项纳入研究均符合HWE平衡。报道的结局指标包括血液毒性、肝毒性、肾毒性及口腔黏膜炎等不良反应，不良反应分级标准多为WHO标准或CTCAE。纳入研究基本信息见表1。

表1 纳入研究基本信息Tab 1 General information of included studies

2.2 方法学质量评价结果

表2 纳入研究的方法学质量评价结果Tab 2 Methodological quality evaluation of included studies

2.3 MTHFR C677T多态性与HD-MTX不良反应的相关性分析

共 6项研究[10-11，17-19，21]评估了MTHFR C677T基因多态性与HD-MTX不良反应的相关性。对于肝毒性、肾毒性、口腔黏膜炎，相关性分析结果见表3。

2.3.1 肝毒性发生率 ①相关性。对于G1-4肝毒性发生率，单项研究提示MTHFR C677T多态性与G1-4肝毒性不存在显著相关性。对于G1-2肝毒性发生率，3种遗传模型下MTHFR C677T多态性与G3-4肝毒性[TT/CTvs.CC：OR＝2.02，95%CI（0.85，4.80）；TTvs.CT/CC：OR＝0.68，95%CI（0.21，2.18）；Tvs.C：OR＝1.27，95%CI（0.63，2.57）]均无显著相关性。对于G3-4肝毒性发生率，3种遗传模型下MTHFR C677T多态性与G3-4肝毒性[TT/CTvs.CC：OR＝0.50，95%CI（0.21，1.18）；TTvs.CT/CC：OR＝1.47，95%CI（0.46，4.69）；Tvs.C：OR＝0.79，95%CI（0.39，1.60）]均无显著相关性。亚组分析结果表明，亚洲患儿与高加索患者间的差异不具有显著性（P亚组＞0.05），MTHFR C677T与G1-2、G3-4肝毒性相关性的Meta分析森林图见图1、图2。

②敏感性分析、异质性分析与发表偏倚分析。对肝毒性发生率的6个Meta分析结果进行敏感性分析。剔除Park JA等[17]的研究后，显性遗传模型下的两项Meta分析合并效应量发生显著改变，但其他遗传模型下的Meta分析合并效应量均未发生显著改变，整体稳定性与可靠性尚可。同时，肝毒性有关的Meta分析均不存在异质性，P异质性＞0.10、I2≤32%。由于Meta分析均只纳入2项研究[17-18]，此时倒漏斗图识别发表偏倚的敏感性较低，发表偏倚无法排除。

2.3.2 肾毒性发生率 ①相关性。对于G1-4肾毒性发生率，3种遗传模型下，均有研究表明MTHFR C677T多态性与G1-4肾毒性发生风险有显著相关性（P＜0.05）。对于G1-2肾毒性发生率，3种遗传模型下MTHFR C677T多态性与G1-2肾毒性均无显著相关性（P＞0.05）。对于G3-4肾毒性发生率，显性遗传模型下MTHFR C677T多态性与G3-4肾毒性有显著相关性[TT/CTvs.CC：OR＝12.35，95%CI（3.28，46.42），P＜0.001]，MTHFR C677T与G3-4肾毒性相关性的Meta分析森林图见图3。

表3 MTHFR C677T基因多态性与肝毒性、肾毒性和口腔黏膜炎的相关性Tab 3 Association between MTHFR C677T gene polymorphism and hepatic toxicity，renal toxicity and oral mucositis

图1 MTHFR C677T与G1-2肝毒性相关性的Meta分析森林图（TT vs.CT/CC）Fig 1 Forest plot for Meta-analysis of association between MTHFR C677T and G1-2 hepatic toxicity（TT vs.CT/CC）

图2 MTHFR C677T与G3-4肝毒性相关性的Meta分析森林图（TT vs.CT/CC）Fig 2 Forest plot for Meta-analysis of association between MTHFR C677T and G3-4 hepatic toxicity（TT vs.CT/CC）

图3 MTHFR C677T与G3-4肾毒性相关性的Meta分析森林图（TT/CT vs.CC）Fig 3 Forest plot for Meta-analysis of association between MTHFR C677T and G3-4 renal toxicity（TT/CT vs.CC）

②敏感性分析、异质性分析与发表偏倚分析。对重度肾毒性发生率的3个Meta分析结果进行敏感性分析。由于Meta分析均只纳入2项研究[10，17]，剔除任华益等[10]的研究后，3种遗传模型下的Meta分析合并效应量量均发生显著改变，提示Meta分析稳定性欠佳。此外，隐性遗传模型下的Meta分析存在显著异质性（P异质性＝0.04、I2＝77%），异质性可能源于患儿和混合人群间的显著差异（P亚组＜0.05）。同时，发表偏倚仍无法排除。

2.3.3 口腔黏膜炎发生率 ①相关性。对于G1-4口腔黏膜炎发生率，3种遗传模型下C677T多态性与G1-4口腔黏膜炎发生风险均存在显著相关性，其中隐性遗传模型（TTvs.CT/CC）的OR＝2.27，95%CI（1.20，4.27），P＝0.01，MTHFR C677T与口腔黏膜炎相关性的Meta分析森林图见图4。

图4 MTHFR C677T与G1-4口腔黏膜炎相关性的Meta分析森林图（TT vs.CT/CC）Fig 4 Forest plot for Meta-analysis of association between MTHFR C677T and G1-4 oral mucositis（TT vs.CT/CC）

对于G1-2口腔黏膜炎发生率，单项研究提示3种遗传模型下C677T多态性与G1-2口腔黏膜炎均无显著相关性（P＞0.05）。对于G3-4口腔黏膜炎发生率，C677T多态性与G3-4口腔黏膜炎有显著相关性[TT/CTvs.CC：OR＝2.84，95%CI（1.25，6.45），P＝0.01；Tvs.C：OR＝2.04，95%CI（1.06，3.93），P＝0.03]，MTHFR C677T与重度口腔黏膜炎相关性的Meta分析森林图见图5、图6。

图5 MTHFR C677T与G3-4口腔黏膜炎相关性的Meta分析森林图（TT/CT vs.CC）Fig 5 Forest plot for Meta-analysis of association between MTHFR C677T and G3-4 oral mucositis（TT/CT vs.CC）

图6 MTHFR C677T与G3-4口腔黏膜炎相关性的Meta分析森林图（T vs.C）Fig 6 Forest plot for Meta-analysis of association between MTHFR C677T and G3-4 oral mucositis（T vs.C）

亚组分析结果表明，高加索与亚洲人群、患儿与混合人群间差异均没有显著性（P亚组＞0.05）。

②敏感性分析、异质性分析与发表偏倚分析。对口腔黏膜炎发生率的4个Meta分析结果进行敏感性分析。由于Meta分析均只纳入2项研究，剔除任华益等[10]或Park JA等[17]的研究后，Meta分析合并效应量均发生显著改变，即整体稳定性与可靠性欠佳。上述Meta分析均无显著异质性，P异质性均＞0.10。此外，由于纳入研究数量的限制，发表偏倚仍无法排除。

2.3.4 血液毒性、消化道毒性、整体不良事件发生率 ①血液毒性发生率方面，任华益等[10]提示隐性遗传模型下MTHFR C677T多态性与白细胞减少、G3-4白细胞减少的发生风险显著相关（P＜0.05），Ana Patino-Garcia等[21]提示MTHFR C677T多态性与G3-4血液毒性的发生风险显著相关（P＜0.05），而Lambrecht L等[11]提示MTHFR C677T多态性与粒细胞减少、血小板减少、血红蛋白降低均无显著相关性（P＞0.05）。②消化道毒性发生率方面，Jabeen S等[18]提示MTHFR C677T多态性与消化道毒性显著相关（P＜0.05）。③整体不良事件发生率方面，周新科等[19]提示MTHFR C677T多态性与整体不良事件无显著相关性（P＞0.05）。

2.4 MTHFR A1298C多态性与HD-MTX不良反应的相关性分析

5项研究[17-21]报道了MTHFR A1298C基因多态性与HD-MTX不良反应的相关性。仅单项研究报道了相关结局指标的具体数据，因此进行描述性分析。（1）血液毒性发生率方面，Windsor RE等[20]的研究中MTHFR A1298C多态性与血红蛋白降低显著相关（P＜0.05），而Ana Patino-Garcia等[21]研究中表明无此相关性。（2）肝毒性发生率方面，Park JA等[17]与Jabeen S等[18]提示，MTHFR A1298C多态性与肝毒性、G1-2肝毒性、G3-4肝毒性均无显著相关性（P＞0.05）。（3）肾毒性发生率方面，Park JA 等[17]与 Ana Patino-Garcia 等[21]提 示 ，MTHFR A1298C多态性与肾毒性、G1-2肾毒性、G3-4肾毒性（AA/ACvs.CC：OR＝0.52）均无显著相关性（P＞0.05）。（4）口腔黏膜炎发生率方面，Park JA等[17]与Jabeen S等[18]提示，MTHFR A1298C多态性与口腔黏膜炎、G1-2口腔黏膜炎、G3-4口腔黏膜炎（AA/ACvs.CC：OR＝0.40）均无显著相关性（P＞0.05）。（5）消化道毒性发生率方面，Ana Patino-Garcia等[21]提示无显著相关性（P＞0.05）。（6）整体不良事件发生率方面，周新科等[19]也提示无显著相关性（P＞0.05）。

2.5 RFC1 G80A多态性与HD-MTX不良反应的相关性分析

4项研究[16-18，21]报道了RFC1G80A基因多态性与HD-MTX不良反应的相关性。仅单个研究报道了相关结局指标的具体数据，因此进行描述性分析。（1）血液毒性发生率方面，2项研究[16，21]提示无显著相关性（P＞0.05）。（2）肝毒性发生率方面，3项研究[16-18]提示，RFC1G80A多态性与肝毒性、G1-2肝毒性、G3-4肝毒性（AA/GAvs.GG：OR＝0.27）无显著相关性（P＞0.05）。（3）肾毒性发生率方面，2项研究[17，21]提示，RFC1G80A多态性与肾毒性、G1-2肾毒性、G3-4肾毒性（AA/GAvs.GG：OR＝0.81）无显著相关性（P＞0.05）。（4）口腔黏膜炎发生率方面，Park JA等[17]提示亚洲患儿中RFC1G80A多态性与G1-2口腔黏膜炎（AA/GAvs.GG：OR＝16.80）、G3-4口腔黏膜炎（AA/GAvs.GG：OR＝0.06）显著相关（P＜0.05），而在Jabeen S等[18]的研究中无显著相关性。（5）消化道毒性发生率方面，Ana Patino-Garcia等[21]提示RFC1G80A多态性与消化道毒性无显著相关性（P＞0.05）。

2.6 MDR1 C3435T多态性与HD-MTX不良反应的相关性分析

仅2项研究[16，20]报道了高加索人群中MDR1C3435T多态性与HD-MTX不良反应的相关性。Windsor RE等[20]指出，MDR1C3435T多态性与口腔黏膜炎发生风险有显著相关性（CCvs.TT：OR＝7.5，P＜0.05）。而Hegyi M等[16]提示，MDR1C3435T多态性与血液毒性、肝毒性无显著相关性（Tvs.C：P＞0.05）。

3 讨论

3.1 基因多态性与HD-MTX不良反应的相关性

基于对 6 项研究[10-11，17-19，21]的 Meta分析和描述性分析，本研究发现，骨肉瘤患者中MTHFR C677T突变可能导致HD-MTX不良反应的发生风险增加，如G3-4血液毒性、肾毒性、G3-4肾毒性、口腔黏膜炎、G3-4口腔黏膜炎、消化道毒性等，但不包括恶性血液肿瘤患者中与MTHFR C677T显著相关的肝毒性[22-23]。受Meta分析纳入的研究数量限制，亚组分析未能充分开展，但基于年龄分层的亚组分析表明，MTHFR C677T与HD-MTX特定不良反应（G3-4肾毒性）的相关性还可能受年龄影响。基于对5项研究[17-21]的Meta分析和描述性分析，本文发现MTHFR A1298C多态性可能与更低的G3-4毒性风险有关，如G3-4肝毒性、G3-4肾毒性、G3-4口腔黏膜炎，但均无统计学意义。总体来说，骨肉瘤患者中MTH-FR C677T突变可能导致HD-MTX不良反应发生风险增加，而MTHFR A1298C多态性可能导致不良反应发生风险降低（但无统计学意义），这与血液恶性肿瘤患者中系统评价的研究相关结果[7，22-23]大体一致。

基于对4项研究[16-18，21]的描述性分析，本文发现骨肉瘤患者中RFC1G80A多态性与HD-MTX不良反应无显著相关性，与血液恶性肿瘤患者中系统评价的研究结果类似[24]，但相关性还可能受种族、年龄、不良事件的定义与分级影响。基于对2项研究[16，20]的描述性分析，仅纳入较小样本量的单个研究提示MDR1C3435T突变可能降低口腔黏膜炎发生风险，但其他结局指标中均无相关性。总体来看，由于受纳入研究数量与质量的限制，RFC1G80A或MDR1C3435T多态性与HD-MTX不良反应的相关性仍不明确。

3.2 HD-MTX相关不良反应的发生机制

同多数药源性不良反应类似，HD-MTX引起不良反应的机制也尚不明确。MTX的血浆蛋白结合率约50%，部分经肝细胞代谢转化为多聚谷氨酸化的MTX（PGMTX），PGMTX被认为是MTX发挥抗增殖活性的活性物[25]。MTX几乎90%通过肾经尿液以原型排泄，少量药物以原型排泄入胆汁并进入肠肝循环，大约10%原型药物会由肝的醛氧化酶代谢为7-羟基MTX（7-OHMTX）[26]。大部分MTX会在给药后12 h内排泄，少量MTX及其代谢产物以结合型（PGMTX、7-OHMTX）贮存于肾和肝等组织中。HD-MTX相关不良反应多见于代谢与增殖迅速的组织，如骨髓、肝、肾、消化道等，HD-MTX对不同系统、器官产生损伤的机制可能不一致。由于MTX对上皮细胞具有直接损伤作用，口腔黏膜炎常是HD-MTX毒性反应的最早期症状，且与较高水平的MTX血药浓度有关[27]。而HD-MTX相关的肝、肾损伤则可能与蓄积在肝、肾组织的PGMTX、7-OHMTX有关，不一定因较高的MTX血药浓度引起。与游离MTX相比，PGMTX对二氢叶酸还原酶（DHFR）的结合亲和力更强，抑制作用更强，且更易于在细胞内蓄积，因此PGMTX的抗增殖活性更强，也导致不良反应发生风险更高、程度更严重[28]。与游离MTX相比，7-OHMTX对DHFR抑制作用较弱，但因水溶性较差，易于在肾内沉积、进而导致肾损害[29]。

3.3 本研究的优势、意义与局限性

目前，尚无针对骨肉瘤患者中上述基因多态性和HD-MTX不良反应相关性的系统评价。HD-MTX用于骨肉瘤时剂量可达10 g/m2，剂量为恶性血液肿瘤患者中3倍以上，更高的MTX血药浓度和更长的暴露时间导致骨肉瘤患者中MTX代谢产物（如PGMTX、7-OHMTX）水平显著高于恶性血液肿瘤患者，因此二者不良反应发生率与严重程度也有所不同。本研究首次系统回顾并整合了骨肉瘤患者的有关研究证据，但尚存在以下局限性：目前相关的原始研究数与样本量均较少，未能充分开展亚组分析，Meta分析结果的稳定性一般，且发表偏倚无法排除，仍需要进一步扩大样本验证本研究结论。此外，不同研究间结局指标的分级与定义存在差异，且部分研究未报告结局指标具体数值，所以部分结局指标无法纳入Meta分析，只可进行描述性分析。因此，仍需要多中心、更大样本量、更高质量的原始研究评估骨肉瘤中相关基因多态性对HD-MTX不良反应的影响。

综上所述，骨肉瘤患者中MTHFR C677T突变可能导致HD-MTX不良反应（如G3-4血液毒性、肾毒性、口腔黏膜炎、消化道毒性）发生风险增加，MTHFR A1298C多态性与HD-MTX不良反应无显著相关性。RFC1G80A或MDR1C3435T多态性与HD-MTX不良反应的相关性尚不明确。临床用药时，应结合MTHFR基因的检测结果与患者个体的临床情况，综合评估HD-MTX不良反应发生风险，必要时进行剂量调整，以最大限度地保证HD-MTX临床用药的安全性，最终改善骨肉瘤患者的临床结局。