叶酸修饰磁性氧化石墨烯载体的制备、表征及其磁性研究Δ

赵鹏慧，王彦，刘雪颖，王永利，刘家园，王立华#

（1.河北北方学院应用化学研究所，河北张家口075000；2.陆军第八十一集团军医院药剂科，河北张家口 075000）

自二维炭材料被发现以来，备受各领域研究人员的关注[1]，如碳纳米管、富勒烯、石墨烯及其衍生物等，其中石墨烯的一种衍生物——氧化石墨烯（GO）作为新型材料，具有廉价、易得、性能优良的优点[2]。GO有大的表面积，且含有—COOH、—OH、—O—等含氧官能团[3]，具有良好的亲水性和生物相容性，可通过π-π共轭和静电作用与药物分子结合[4-5]，因具有被动靶向性[6]，而使其成为理想的药物载体。研究者们利用GO上的官能团与其他小分子进行各种化学反应，对GO进行各种功能化修饰，以改善GO的分散性、生物相容性，降低其细胞毒性，增强其作为药物载体对病灶部位的靶向性等。

近年来，对于功能化GO载体的研究取得了很大的进展，如沈俊海等[7]采用原位化学共沉淀法制备磁性氧化石墨烯（GO-Fe3O4）复合材料，并研究了其对盐酸多柔比星的负载和释放性能，在新型药物载体领域有可观的利用率；Kooti M等[8]研究发现，GO-Fe3O4在磁性环境下可以把负载的药物运输到特定病变部位，提示GO-Fe3O4具有磁靶向性，在药物传送中具有潜在价值。由于单独的磁性粒子容易聚沉[9]，所以磁化后的GO-Fe3O4分散液易产生聚沉现象，分散性差，从而使复合载体的稳定性降低。据报道，叶酸（FA）受体是一种糖蛋白，在许多肿瘤细胞表面高度表达，而在正常细胞表面低表达[10]，具有一定的生物靶向性，如张蛟龙等[11]制备FA修饰的GO载体（FA-GO），装载盐酸多柔比星后，FA-GO对盐酸多柔比星的载药效率高，且具有一定的缓释性能及细胞靶向性。

为了改善GO-Fe3O4的稳定性，增加靶向性，本研究以GO、六水合氯化铁（FeCl3·6H2O）、四水合氯化亚铁（FeCl2·4H2O）以及FA为主要原料，采用水热共沉淀法制备了FA修饰磁性氧化石墨烯（FA-GO-Fe3O4）复合材料，利用复合材料中Fe3O4纳米粒子的磁靶向性和FA的生物靶向性，为抗肿瘤药物“双重”靶向载体研究与开发提供新方法和新思路。

1 材料

1.1 仪器

S4800-Ⅱ型场发射扫描电镜（日本日立公司）；FTIR-650型傅里叶变换红外光谱仪（天津港东科技发展股份有限公司）；XRD-7000型X射线衍射仪（日本岛津公司）；Zetasizer Nano ZS90NEW型粒度及Zeta电位分析仪（英国Malvern公司）；PPMS DynaCool型磁滞回线仪（美国Quantum Design公司）；KQ-500E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Exceed-Cd-16型艾柯超纯水机（成都唐氏康宁科技发展有限公司）；pHS-3C型pH计（上海仪电科学仪器股份有限公司）；T-214型电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市予华仪器有限责任公司）；DZF-6020型真空干燥箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；FD-1-50型真空冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限公司）；2XZ（C）型直联旋片式真空泵（临海市谭氏真空设备有限公司）。

1.2 药品与试剂

GO原料药（湖北丰化材料发展有限责任公司，批号：20121218，纯度：99.0%）；FeCl3·6H2O（天津市福晨化学试剂厂，分析纯）；FeCl2·4H2O（天津市巴斯夫化工有限公司，分析纯）；FA原料药（上海麦克林生化科技有限公司，批号：C10058442，纯度：97%）；N-羟基琥珀酰亚胺（NHS，上海思域化工科技有限公司，批号：A1512061，纯度：99%）；1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐（EDC，国药集团化学试剂有限公司，批号：20170927，纯度：95%）；HCl、NH3·H2O、CH2ClCOOH、NaOH等均为市售分析纯。

2 方法

2.1 GO-Fe3O4的制备

取GO 100.0 mg，加适量蒸馏水，常温下以频率40 kHz、功率500 W超声分散30 min，配制成质量浓度为1.00 mg/mL的GO分散液，用HCl调节体系pH至3.00；加入0.300 0 g FeCl3·6H2O和0.300 0 g FeCl2·4H2O，常温下以频率40 kHz、功率500 W超声至溶解，置于密闭容器中，氮气保护，30℃密闭熟化4 h；再用NH3·H2O调节pH至11.00，氮气保护，80℃密闭熟化4 h，利用磁性分离产物，并用蒸馏水洗涤至洗液pH至7.00，得到黑色固体，60℃干燥至恒质量，即得GO-Fe3O4，约140.0 mg。

2.2 FA-GO-Fe3O4的制备

取“2.1”项下制备的GO-Fe3O4100.0 mg，加蒸馏水配制成质量浓度为1.00 mg/mL的GO-Fe3O4分散液，常温下以频率40 kHz、功率500 W超声溶解2 h，加入5.000 0 g CH2ClCOOH，溶解后加入5.000 0 g NaOH，常温下以频率40 kHz、功率500 W超声3 h，用6 mol/L盐酸调pH至中性，转入透析袋中，30℃恒温透析48 h，透析液为水，24 h换一次，冷冻干燥48 h，即得到羧基化GO-Fe3O4材料，约80.0 mg。精密称取羧基化GO-Fe3O4材料50.0 mg，加蒸馏水，常温超声分散1 h，配制成质量浓度为1.00 mg/mL的羧基化GO-Fe3O4分散液，加入45.50 mg NHS、31.25 mg EDC，常温下以频率40 kHz、功率500 W超声2 h，然后边搅拌边加入25.0 mg FA，30℃搅拌3 h，转入透析袋中，30℃恒温透析48 h，24 h换一次，冷冻干燥，即得FA-GO-Fe3O4，约50.0 mg。

2.3 FA-GO-Fe3O4的表征

2.3.1 外观和微观结构 采用S4800-Ⅱ型场发射扫描电镜观察GO、GO-Fe3O4和FA-GO-Fe3O4的外观和微观结构。

2.3.2 红外结构特征 采用FTIR-650型傅里叶变换红外光谱仪分析FA、GO、GO-Fe3O4和FA-GO-Fe3O4的红外结构特征，先用115℃干燥3 h的溴化钾与60℃干燥6 h的样品均匀混合后，压片，在分辨率为4 cm－1，扫描范围为400～4 000 cm－1的条件下进行测试。

2.3.3 X射线衍射分析 采用XRD-7000型X射线衍射仪分析GO、GO-Fe3O4和FA-GO-Fe3O4的晶型结构特征，管电压为40 kV，管电流为30 mA，2θ为5 °～80 °。

2.3.4 Zeta电位 采用Zetasizer NanoZS90NEW型粒度及Zeta电位分析仪测定GO、GO-Fe3O4和FA-GO-Fe3O4的Zeta电位，分散剂为蒸馏水，散射角为90°，温度为25℃，测试3遍，取平均值。

2.4 性能测试

2.4.1 外加磁场的作用 取质量浓度为0.5 mg/mL的FA-GO-Fe3O4水分散液2 mL，置于样品瓶中，在瓶外放置一块磁铁，观察制备的FA-GO-Fe3O4在外加磁场作用下的分布变化。

2.4.2 磁滞回线 采用PPMS DynaCool型磁滞回线仪，在室温（300 K，即27℃）下测量FA-GO-Fe3O4的磁滞回线，扫描范围为－20 000～20 000 Oe。

3 结果

3.1 表征

3.1.1 扫描电镜图 GO、GO-Fe3O4和FA-GO-Fe3O4的扫描电镜图见图1。

由图1显示，GO呈薄层鳞片状，表面较光滑。由于GO-Fe3O4是按照共沉淀法制备的，在GO连接Fe3O4的过程中Fe3O4吸附于GO表面或内部，破坏了GO的片层结构，因此GO-Fe3O4扫描电镜图显示其表面有突起出现。当GO-Fe3O4与FA复合后，虽然同样破坏了GO的片层结构，但由FA-GO-Fe3O4扫描电镜图显示其破坏似乎并不完全，部分片层呈弯曲状，且表面有粒子团附着，呈现出与GO和GO-Fe3O4皆不同的结构。初步表明FA-GOFe3O4复合材料制备成功。

3.1.2 红外光谱图分析 GO、FA、Fe3O4和FA-GO-Fe3O4的红外光谱图见图2。

图1 GO、GO-Fe3O4和FA-GO-Fe3O4的扫描电镜图Fig 1SEM image of GO，GO-Fe3O4and FA-GO-Fe3O4

图2 GO、FA、Fe3O4和FA-GO-Fe3O4的红外光谱图Fig 2 IR images of GO，FA，Fe3O4and FA-GO-Fe3O4

由图2显示，FA-GO-Fe3O4在3 400～3 500 cm－1附近有一个明显的吸收峰，属于—OH伸缩振动峰，由于此处峰形较大，除—OH的伸缩振动峰外，还可能是因为干燥过的样品在测定时吸收了空气中的少量水分形成的；与GO的红外光谱图对比，FA-GO-Fe3O4红外光谱图中增加了574 cm－1吸收峰，结合Fe3O4的红外吸收峰，该峰可能是Fe-O键的吸收峰[12]；且FA-GO-Fe3O4在1 640 cm－1处有吸收峰，属于—CONH—特征吸收峰，该峰可能是由羧基化GO-Fe3O4的—COOH与FA的游离—NH2发生酰胺反应形成的；由于FA分子内部有酰胺键的存在，所以在1 642 cm－1处能观察到很弱的吸收峰，由于FA与GO-Fe3O4的连接形成了更多的酰胺键，透过率更小，吸收强度更大，峰尖也就越接近横轴，对比FA，FA-GOFe3O4中的该吸收峰更强；在FA-GO-Fe3O4红外光谱图中，3 412 cm－1和3 320 cm－1处没有吸收峰，表明游离胺基反应完全；在1 600～1 700 cm－1附近，FA-GO-Fe3O4的吸收峰多且杂，对应的可能是GO中—COOH的C＝O以及CO—H的伸缩振动峰[13]；GO红外光谱图中的1 723 cm－1吸收峰[14]出现在了FA-GO-Fe3O4红外光谱图中的1 694 cm－1处，表明GO中的—COOH发生了反应，从而产生了位移。

3.1.3 X射线衍射分析 GO、GO-Fe3O4和FA-GO-Fe3O4的X射线衍射图见图3。

图3 GO、GO-Fe3O4和FA-GO-Fe3O4的X射线衍射图Fig 3XRD images of GO，GO-Fe3O4and FA-GO-Fe3O4

由图3显示，GO在11.87°处的衍射峰的衍射强度最大，表明GO具有很好的晶体结构[15]；GO-Fe3O4有6个特征峰，分别在31.5 °、36.47 °、44.09 °、53.4 °、58.62 °、63.75°处，与Fe3O4标准衍射峰[16]位置近乎一致；与GO衍射图对比，FA-GO-Fe3O4的11.87°处没有特征峰，表明FA-GO-Fe3O4在形成过程中破坏了GO的晶体结构[17]，与图1观察的结果和文献报道[17]一致；FA-GO-Fe3O4衍射图中显示在15°～30°之间出现了一个大的隆起，即非晶相峰，该峰的形成可能是由于GO-Fe3O4表面包覆了非晶相的FA引起的。

3.1.4 Zeta电位 结果显示，GO、GO-Fe3O4和FA-GOFe3O4的Zeta电位分别为－24、5.62和－22.7 mV。有研究表明，随着Zeta电位绝对值的增大，体系的稳定性也会增强[18]。由此可以得出，FA-GO-Fe3O4的Zeta电位绝对值明显大于GO-Fe3O4，表明FA通过酰胺键与GO-Fe3O4连接后，增加了该体系的稳定性。

3.2 性能

3.2.1 外加磁场的作用 外加磁场作用下的FA-GOFe3O4分散液图见图4。

图4 外加磁场作用下的FA-GO-Fe3O4分散液外观Fig 4 Appearence of water dispersions of FA-GOFe3O4under magnetic field

由图4可知，在无外加磁场作用下，FA-GO-Fe3O4在水中均匀分散，呈深棕色；在外加磁场作用下，均匀分散在水中的FA-GO-Fe3O4向外加磁场方向移动，聚集在瓶底，呈黑色粉末状，分散液接近无色透明，说明FA-GOFe3O4具有良好的磁靶向性。

3.2.2 磁滞回线 FA-GO-Fe3O4在室温条件下的磁滞回线见图5。

图5 FA-GO-Fe3O4在室温条件下的磁滞回线Fig 5 Hysteresis loop of FA-GO-Fe3O4at room temperature

由图5显示，在室温、外加正反磁场条件下，FA-GOFe3O4材料的磁滞回线呈S型回线，饱和磁化强度约为20～25 emu/g；在没有外在磁场的情况下，该磁滞回线经过原点，所以，矫顽力（Hcm）＝剩余磁化强度（M）＝0，且无磁滞现象产生，表明在室温下，FA-GO-Fe3O4具有良好的超顺磁性[19]。

4 讨论

近年来，恶性肿瘤极大地危害着人类健康，已成为全球较大的公共卫生问题之一[20]，因此抗肿瘤制剂的研究刻不容缓。为了解决传统肿瘤治疗药物缺乏选择性的问题，药物靶向载体已经成为医药学领域的研究热点，如介孔分子筛[21]、功能化GO以及纳米胶束等。由于功能化GO具有优异的载药性能，学者们相继对其进行了各种研究。其中Fe3O4纳米粒颗粒小、磁性强、毒性低，具有良好的生物相容性，易穿过生理屏障，这些优点解决了抗癌药物对癌细胞的非特异性攻击的问题[22-23]。经Fe3O4纳米粒修饰后的GO在这些方面均得到了改善，如高君[22]制备了功能化GO磁靶向载药体系，并考察了该载体的体外磁靶向性，证明该体系具有较好的磁靶向性及其优良的载药性能等。

本研究先后用Fe3O4和FA修饰GO，制备FA-GOFe3O4复合载体。通过扫描电镜、红外光谱以及X射线衍射测定结果表明，Fe3O4和FA已经复合在GO表面，成功制备了FA-GO-Fe3O4复合材料。该复合材料的饱和磁化强度约为20～25 emu/g，具有较好的超顺磁性，同时具有较好的稳定性，即Zeta电位为－22.7 mV。相较于GO-Fe3O4复合材料，FA-GO-Fe3O4的稳定性好，且具有“双重”靶向性（生物靶向性另文发表），可以运用于不同情况的临床患者，如在被动性物理磁靶向性失效或比较弱的情况下，可以利用FA介导的主动性生物靶向性，直接靶向到肿瘤部位起效，增强疗效。随着科学技术的发展，光动力疗法治疗癌症已经成为一个新的研究热点，因GO可吸收红外光，使其成为了光动力疗法的新载体[24-25]，本研究制备的药物靶向载体也有望应用于该领域，可为癌症的靶向性治疗提供新型纳米载体。