乙烯利对苹果矮化砧T337幼苗硝态氮吸收、分配和利用的影响

李秀丽，郑绪峰，姜远茂，魏绍冲

（山东农业大学园艺科学与工程学院/作物生物学国家重点实验室/山东果蔬优质高效生产协同创新中心，山东泰安 271018）

氮是果树正常生长发育所必需的大量营养元素之一，在保证植物正常代谢和生物量增加方面具有重要的作用。适量的氮肥供应可以促进果树的营养生长、花芽分化，增强叶片的光合作用，进而提高果实的产量与品质[1]。但目前我国果园氮肥施用量远超出果品最佳产量的需要量，高产果园每年氮肥施用量高达400～600 kg/hm2，约为国外施氮量的4～5倍[2]。过多的氮肥用量不仅导致生产成本增加，而且易引起环境污染和果实品质下降等一系列不利于农业可持续发展的负面影响[3]。果园土壤保肥能力差，导致氮肥用量大，而氮肥过量施用则加剧了果园土壤的氮素环境负荷，降低果园土壤质量，反过来促使果园氮肥用量增加，形成恶性循环[4]。因此，从保护环境和改善果实品质等多方面考虑，减少氮肥用量并相应地提高氮肥利用效率是目前果树生产上亟待解决的问题，是绿色果业可持续发展的有力保障。

植物激素乙烯是一种简单的气态植物激素，它不仅能够调节植物生长发育和适应环境胁迫，而且还影响营养元素吸收利用过程中的信号转换，与植株对养分的吸收利用效率密切相关[5]。但是目前有关乙烯与植物营养元素利用之间的关系报道较少，它们之间的相互作用可以被应用于调节植物响应不断变化的环境和农业可持续发展方面[6]。许晅发现乙烯生成前体物ACC (氨基环丙烷羧酸) 处理可以诱导玉米根系产生更多根毛，增大根系吸收面积和提高根系活力，从而增强植株对养分的吸收和利用能力[7]。在0～120 mg/kg等间隔的4种土壤氮水平下，200 μL/L乙烯利处理均可以改变芥菜叶片气孔导度、叶片光合速率、植株生物量以及氮素的利用效率[8]。在氮素供应充足的条件下，乙烯利处理对氮肥利用率的影响效果尤为显著[9]。

本试验以现代苹果生产中常用矮化砧木T337幼苗为试验材料，分析比较叶面喷施乙烯利对硝酸还原酶 (nitrate reductase，NR) 和谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，GS) 活性，以及氮素吸收、分配和利用的影响，以期为果树生产管理中氮肥高效利用提供合理的科学依据及新思路。

1 材料与方法

1.1 试验材料与设计

试验于2017年3—9月在山东农业大学园艺试验站进行，以苹果矮化自根砧T337幼苗为试验材料。待幼苗在育苗基质中长至9片叶左右时，选取生长势和大小基本一致的幼苗定植于塑料盆中，每板15孔，每孔定植3株，每盆45株。每盆加入营养液3 L。先用1/2浓度Hoagland营养液预培养7天后，再换为完全营养液培养25 天，随后饥饿处理7天，以消耗幼苗中贮存氮，预处理结束后转入改良Hoagland营养液中进行培养。以Ca(15NO3)2(上海化工研究院生产，丰度为10.16%) 为营养液唯一氮源，氮浓度为10 mmol/L。分别对幼苗叶片喷施清水或乙烯利。试验中所有溶液均用蒸馏水配制，各营养元素所用试剂纯度为分析纯，每日定时通气。

乙烯利处理浓度为：E1，200 μL/L；E2，400 μL/L；对照为喷清水 (CK)。每个处理重复4次，每盆为1个重复。处理后每隔4天取样，分别测定不同处理幼苗根系活力及根系和叶片的硝酸还原酶 (NR)和谷氨酰胺合成酶 (GS) 活性，并于处理后第20天取样分析幼苗15N的吸收、分配和利用。

1.2 样品采集与测定

1.2.1 根系活力 每个处理选取9株幼苗，采用氯化三苯基四氮唑 (TTC) 法测定，用四氮唑的还原强度[μg/(g·h)]表示根系活力。

1.2.2 硝酸还原酶活性 根系和叶片中的硝酸还原酶活性参照李合生的活体法测定[10]。测定各处理生成的红色偶氮化合物在540 nm波长下的最大吸收峰，与标准曲线对照，计算样品中NR活性[μg/(g·h)]。

1.2.3 谷氨酰胺合成酶活性 根系和叶片中谷氨酰胺合成酶活性的测定参照赵世杰等的方法[11]。分别提取根系和叶片粗酶液，与反应液和ATP混匀后，加入显色剂，离心，取上清液测定540 nm处的吸光值来表示 GS 活性[A/(mg·h)]。

1.2.4 幼苗15N吸收、分配和利用 处理20 d后将15N标记幼苗清洗干净，解析为根、茎、叶三部分，在105℃下杀青30 min，随后在80℃下烘干至恒重。样品用不锈钢电磨粉碎后过60目筛，混匀后装袋备用，测定各器官15N丰度和器官全氮量。样品全氮用凯氏定氮法测定，15N丰度在中国农业科学院农产品加工研究所用MAT-251气体同位素质谱仪 (美国菲尼公司) 测定。

1.3 数据处理

主要计算公式：

Ndff (%) = (植物样品中15N丰度% -15N自然丰度%) / (肥料中15N丰度% -15N自然丰度%) × 100

器官15N吸收量 (g) = Ndff × 器官全氮量 (g)

器官全氮量 (g) = 器官生物量 (g) × 氮含量 (%)

氮肥利用率 (%) =15N吸收量 (g)/施肥量 (g) × 100

氮肥分配率 (%) = 各器官从氮肥中吸收的氮量(g) / 总吸收氮量 (g) × 100

试验数据采用SPASS19.0进行单因素方差分析，LSD法进行差异显著性检验。所有数据均采用Microsoft Excel 2003进行图表绘制，图表中数据为平均值 ± 标准误。

2 结果与分析

2.1 乙烯利对幼苗根系活力的影响

乙烯利处理后幼苗的根系活力均不同程度高于同时期的对照(图1)。各处理根系活力随处理时间延长呈现先上升后下降的趋势，在第8天达到最大值，且不同处理间差异显著，E1、E2处理分别比对照高19.68%和63.40%。在处理后20天内，E2处理幼苗根系活力一直明显高于同期的对照。

图1 喷乙烯利后T337幼苗根系活力Fig. 1 Root activities of T337 seedlings after ethephon spray

2.2 乙烯利对幼苗硝酸还原酶 (NR) 活性的影响

2.2.1 乙烯利对叶片硝酸还原酶 (NR) 活性的影响

处理后8～12天内，乙烯利处理的幼苗叶片中NR活性明显高于对照，在第8 天不同处理的叶片NR活性均达到最大值，两个不同浓度乙烯利处理的NR活性分别比对照高17.30%和39.38%；而16～20天的两个处理叶片中NR活性则显著低于对照，而且E2处理叶片NR活性低于E1(图2A)。

2.2.2 乙烯利对根系硝酸还原酶 (NR) 活性的影响

比较幼苗叶片和根系部位处理后同一时期的NR活性，可发现对照和E1处理幼苗叶片中的NR活性在20天内一直高于同期的根系的，而E2处理12天内叶片的NR活性高于根系的，但16天后根系中的NR活性反而高于叶片的。由此推测，叶片可能在幼苗硝态氮的同化利用中更关键 (图2)。

图2 喷乙烯利后幼苗叶片和根系硝酸还原酶活性Fig. 2 Nitrate reductase activity in T337 seedling leaves and roots after ethephon spray

与处理后叶片NR活性变化相似，第8天时各个处理根系NR活性也均达到最高，其中E1和E2处理的根系NR活性分别比对照提高21.54%和36.01%。第12天后根系中的NR活性呈现下降趋势，但是同期根的 NR 活性为 E2 〉 E1 〉 CK 处理 (图 2B)。

2.3 乙烯利对幼苗谷氨酰胺合成酶 (GS) 活性的影响

2.3.1 乙烯利对叶片谷氨酰胺合成酶活性的影响处理后12天内两个处理叶片中GS活性比同一时期对照的高，在第8 d各处理之间GS活性差异显著(图3A)。E2处理叶片GS活性在4、8、12天时分别比对照高55.70%、81.03%和46.53%；E1处理叶片GS活性在第8天增幅最大，比对照增加36.21%。12天后叶片中GS活性下降，16天和20天时各处理之间差异不显著。至第20天时，各种处理GS活性均降到0.80 A/(mg·h)左右。

2.3.2 乙烯利对幼苗根系谷氨酰胺合成酶活性的影响

对照幼苗仅在第4天时根系的GS活性低于叶片，8天后叶片GS活性一直高于根系，推测这可能是幼苗从饥饿状态转移到全硝态氮营养液后，根系吸收的氮素前期在根部被直接转化利用有关。

根部GS活性随处理时间呈现先升高后降低的趋势(图3B)。但乙烯利处理的幼苗根系中GS活性比对照高，其中E2处理根中GS活性在8天和12天期间分别比对照显著提高了90.18%和85.90%。12～20天期间各处理根中GS活性出现下降趋势，但同一时期不同处理间GS活性差异不显著。

图3 喷乙烯利后叶片和根系谷氨酰胺合成酶 (GS) 活性Fig. 3 Glutamine synthetase activity in T337 seedling leaves and roots after ethephon spray

2.4 乙烯利对幼苗生物量的影响

表1表明，乙烯利处理的幼苗总干重比对照显著增加，E1和E2处理分别比对照增加20.88%和39.07%。E1处理叶片干重比对照显著增加，但根和茎干重与对照差异不显著。E2处理根系和叶片干重显著高于对照，分别比对照增加86.96%和28.83%。与对照相比，乙烯利处理的幼苗根冠比增加，其中E2处理差异显著，比对照增加42.86%。

表1 喷乙烯利后幼苗各器官的生物量 (g)Table 1 Biomass of seedling organs after ethephon spray

2.5 乙烯利对幼苗各器官15N吸收利用和分配的影响

2.5.1 乙烯利对幼苗各器官Ndff值的影响

Ndff是指植株器官从肥料15N中吸收分配到的15N量对该器官全氮量的贡献率，它反映了器官对肥料15N的吸收征调能力[12]。

与对照相比，E1处理幼苗各部位的Ndff值差异不显著；E2处理根的Ndff值比对照显著增加了63.14%，而茎和叶片的Ndff值差异不显著。说明E2处理可以显著提高幼苗根系对15N的吸收征调能力 (表2)。

表2 喷乙烯利后幼苗各器官的Ndff值 (%)Table 2 Ndff (%) in various organs of seedlings after ethephon spray

2.5.2 乙烯利对幼苗15N利用率和15N分配率的影响

器官中15N占全株15N总量的百分率反映了氮在植株中的分布及在各器官迁移的规律[13]。表3中，不同处理幼苗器官中15N的分配率均为叶 〉 根 〉 茎。E1和E2处理叶片中15N的分配率分别比对照降低了20.4%和30.6%，相应地，乙烯利处理显著提高了幼苗根和茎15N的分配率，E1、E2两个处理根系15N的分配率分别比对照提高33.3%、67.4%，可见E2处理对根系15N分配率提高幅度尤为明显。

表3 喷乙烯利后T337幼苗15N的分配率 (%)Table 3 15N distribution rate of T337 seedlings after ethephon spray

从图4可以看出，不同处理的幼苗15N利用率差异显著，由高至低依次为E2 〉 E1 〉 CK。E1和E2处理的幼苗15N利用率分别达到12.91%和24.79%，而对照仅为9.47%，可见乙烯利处理显著提高T337幼苗15N的利用率，E1和E2处理15N的利用率分别比对照高3.44和15.32个百分点。

图4 喷乙烯利后T337幼苗的15N利用率Fig. 4 15N use efficiency of T337 seedlings after ethephon spray

3 讨论

3.1 乙烯利对T337幼苗氮代谢相关酶活性的影响

果树从土壤中吸收的无机态氮主要为硝态氮和铵态氮，其中根系吸收的硝酸盐在植物体内需进一步转化为谷氨酸和谷氨酰胺等有机氮才能被植物同化利用，而NR和GS是其转化过程中两个关键酶[14]。氮素充足条件下乙烯利处理芥菜10天后，光合速率可比对照高40.3%，叶片中NR活性和氮含量分别比对照高35.9%和26.8%，最终引起植株生物量表现出明显差异[15]。研究表明，外源乙烯能促进侧根的生长和伸长，增大根系吸收面积，显著提高根系活力[16-17]。刘剑锋等发现，玉米无论在干旱或复水条件下，乙烯利处理均能促进其根系生长，并提高叶片中NR活性和GS活性[18]。本试验结果表明，不同处理T337幼苗根系及叶片中NR活性和GS活性呈现先升高后降低的趋势，并在第8天达到最大值。推测这可能与硝酸还原酶活性诱导有关，当幼苗从饥饿状态转移到全硝态氮营养液后，根系会从营养液中大量吸收硝态氮，从而诱导叶片和根系部位NR及GS活性上升，而随着营养液硝态氮不断被幼苗转化利用，两种酶的活性随后开始下降，这种变化与根系活力表现为先升高后降低的趋势是一致的。乙烯利处理提高根系活力，增强根系对硝态氮的吸收能力，另一方面也提高了叶片和根系的NR及GS活性，因此会影响幼苗中硝态氮的转化利用，最终导致乙烯利处理的幼苗生物量高于对照。

3.2 乙烯利对T337幼苗氮素吸收、利用和分配的影响

硝态氮是果树重要的无机氮营养形态，多数试验证明果树是喜硝作物[19]。进入植物体内的硝态氮，如果不能被及时同化和利用，将会明显影响植株的氮素同化效率和生物量的形成，进而显著影响植物的氮利用效率[20-21]。

当土壤环境中养分供应发生变化时，植物根系也会发生一些适应性改变[22]。研究表明，乙烯利对植物营养元素的吸收利用具有重要影响。例如，营养元素缺乏条件下植物产生的乙烯可以增大根系的总吸收表面，提高转运蛋白数量等以更好地满足植物的正常生长和养分需求[6]。

不同供氮水平下，芥菜喷施乙烯利后，叶片的光合速率及植株生物量均显著高于对照，并且在氮供应充足水平下尤为明显，原因主要与处理后叶片气孔导度增大和胞间CO2浓度升高有关[9]。不同品种对乙烯处理的响应有较大差异，4个不同品种芥菜喷施乙烯利后，对乙烯反应最敏感型品种‘Pusa Jai Kisan’叶片中Rubisco酶的活性及光合速率增加显著高于其它品种[23]。

本试验中乙烯利处理的幼苗总生物量，尤其是400 μL/L处理，根系部位的生物量显著高于对照，推测这可能与T337幼苗对乙烯反应的敏感性较高有关。乙烯利处理后的幼苗光合产物向地下部供应增加，促进幼苗根系生长并增强根系对硝态氮的吸收能力；而地上部分叶片由于受氮素供应限制，生长会受到一定程度的影响，因此幼苗根冠比增大，最终导致不同处理的根系氮素分配率存在明显差异，至试验结束时，200 μL/L和400 μL/L乙烯利处理的幼苗根系15N分配率分别比对照增加33.32%和67.40%。

高氮供应条件下T337幼苗氮素同化和根系生长会受到抑制[24]。本试验结果表明乙烯利能够提高根系的氮素分配率，促进T337幼苗地下部的生长，提高根冠比。乙烯利处理的幼苗根系和叶片对硝态氮的同化能力明显加强，最终显著提高幼苗硝态氮利用率。200 μL/L和400 μL/L乙烯利处理的幼苗15N利用率比对照分别高3.44和15.32个百分点。本试验结果为生产中提高果树氮肥利用率及改善氮素分配提供了新思路，但相关研究还有待在田间试验条件下进一步验证。

4 结论

叶片喷施适量的乙烯利能够提高T337幼苗的根系活力，增强根系及叶片中GS和NR的活性，促进体内硝态氮的转化及利用，从而提高幼苗氮肥利用率及根系部位氮素的分配率，增大根冠比。