不同盐度下5种中草药对2种水产动物致病菌的抑菌效果比较

石洪玥 陆颖 卢正义

摘要：采用牛津杯法比较不同盐度（0、1%、2%、3%、4%）下五倍子、石榴皮、诃子、黄芩、乌梅5种中草药对迟缓爱德华氏菌和嗜水气单胞菌的抑菌效果，测定了最小抑菌浓度。结果表明，5种中草药对迟缓爱德华氏菌和嗜水气单胞菌都有不同程度的抑菌效果，其中黄芩和五倍子抑菌作用较强，乌梅抑菌作用较差，而诃子和石榴皮的抑菌作用一般，但石榴皮对嗜水气单胞菌的抑菌作用较为明显。不同盐度下，5种中草药对这2种致病菌的最小抑菌浓度（MIC）有差异。高盐度时，5种中草药对迟缓爱德华氏菌的MIC较低，均≤25 mg/mL，抑菌效果较好;而低盐度时，各个中草药MIC均在25 mg/mL及以上，抑菌效果较差。在盐度为0时，5种中草药对嗜水气单胞菌的MIC最低，抑菌效果最好。

关键词：盐度;中草药;迟缓爱德华氏菌;嗜水气单胞菌抑菌;抑菌效果

中图分类号： S942;S941.42 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2019）01-0162-04

嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）和迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）是2种常见的水产动物致病菌，引起水产动物大量死亡，对水产业造成重大威胁[1-5]。目前，对于各种水产动物致病菌的防御多采用抗生素和化学药物，但抗生素和化学药物长时间使用具有诸多弊端，如增强致病菌的耐药性、造成养殖动物体内药物残留量日趋增多、使养殖水环境受到污染、引起过敏反应等，这些都导致抗生素和化学药物的使用受到限制[6-7]。

近年来，越来越多的中草药被用于防治细菌性传染病。中草药作为一种天然药物，可直接作用于细菌等微生物的结构和代谢而发挥其抗菌作用。研究表明，许多中草药具有明显的杀菌抑菌作用，并具有无抗药性、无残留及不会引起药源性疾病等优点[8-10]。开展抗菌中草药的筛选和应用研究对于动物细菌性疾病的防治具有重要意义[11]。

目前，关于中草药对水产动物致病菌的抑菌、杀菌研究报道较多[12-17]，但中草药在不同盐度下的抑菌、杀菌作用未见报道。鉴于水体盐度对中草药的抑菌效果影响较大[6]，因此研究中草药在不同盐度下的抑菌效果，更具指导意义。本试验在现有报道的基础上[6-9，11-15]，筛选出五倍子（Rhus chinensis）、乌梅（Scutellaria baicalensis）、石榴皮（Terminalia chebula）、黄芩（Prunus mume）和诃子（Punica granatum）5种抑菌、杀菌效果明显的中草药，比较它们在不同盐度下（0、1%、2%、3%、4%）对迟缓爱德华氏菌和嗜水气单胞菌的抑菌效果，为上述5种中草药在不用盐度养殖水体中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验药品 五倍子、黄芩、诃子、乌梅、石榴皮5种中草药购自天津市某大药房，粉碎后保存备用。试验于5月中旬在天津市水产生态及养殖重点实验室进行。

1.1.2 培养基 营养琼脂（北京澳博星生物技术有限责任公司）;Mueller-Hinton培养基（北京索莱宝科技有限公司）。

1.1.3 试验菌种 迟缓爱德华氏菌和嗜水气单胞菌均由天津农学院天津市水产生态及养殖重点实验室提供。

1.2 试验方法

1.2.1 菌悬液的制备 迟缓爱德华氏菌和嗜水气单胞菌在超净工作台上进行菌种活化。取已灭菌离心管，分别加入 1 mL 生理盐水备用。再用接种环从盛有源菌的培养基中沾取源菌，将其放入上述盛有生理盐水的离心管中，充分混匀成菌溶液备用。

分别吸取2种菌溶液各100 μL于营养琼脂培养基上涂布均匀，置于恒温培养箱中28 ℃培养24 h，后用生理盐水冲洗培养基获得菌液，并放入4 ℃冰箱中保存，红细胞计数板估算菌液浓度约为2×109 CFU/mL，使用时用生理盐水稀释成浓度约为108 CFU/mL的菌悬液。

1.2.2 试验药物的制备 使用水提法[18-19]制备试验药液。五倍子、黄芩、诃子、乌梅、石榴皮各取50 g于烧杯中，分别加入500 mL蒸馏水，浸泡30 min后煎煮，并用玻璃棒不断搅动，待煮沸后用文火煮30 min，滤出药液，继续加水煎煮，重复3次，合并滤液，旋转蒸发至250 mL，所得中草药水提物折合成生药为200 mg/mL，高压蒸汽灭菌后于4 ℃冰箱中保存备用，使用前充分振荡。

1.2.3 不同盐度下5种中草药对迟缓爱德华氏菌和嗜水气单胞菌的抑菌效果比较 将高盐度卤水过滤后加入蒸馏水并高压灭菌，配制成盐度分别为0、1%、2%、3%、4%的无菌水，将Mueller-Hinton培养基粉末溶于不同盐度的无菌水中，倒入玻璃培养皿制备成固体培养基。采用牛津杯法（管碟法）[20]测定5种中草药在不同盐度（0、1%、2%、3%、4%）下对2种致病菌的最小抑菌浓度（MIC）。吸取100 μL菌液均匀涂布于固体培养基上，每个培养皿等间距放置3个牛津杯，轻压使其与培养基紧密接触。向牛津杯中加200 μL药液，28 ℃ 培养24 h，测量抑菌圈直径。

1.2.4 不同盐度下5种中草药对爱德华氏菌和嗜水气单胞菌的最小抑菌浓度的测定 用二倍稀释法，将中草药液稀释为200、100、50、25、12.5、6.25、3.125 mg/mL。吸取各浓度中草药溶液200 μL，加入到不同盐度培养皿的牛津杯中，作为药物浓度梯度组。加药完毕后于恒温培养箱中28 ℃培养 24 h 后，观察结果，以牛津杯周围透亮有抑菌圈表示细菌不生长（-），牛津杯周围模糊不清无抑菌圈表示有细菌生长（+）。能够抑制细菌正常生长的最低药物浓度即为5种中草药对该种细菌的最小抑菌浓度（MIC）。

1.3 数据统计与分析

将所得数据用SPSS 19.0做單因素方差分析，差异显著（P<0.05）的用Duncans法做多重比较，表中数据用“平均 值± 标准误”表示，n=3。

2 结果与分析

2.1 中草药对迟缓爱德华氏菌的抑菌圈直径

由表1可知，盐度不同时5种中草药原液对迟缓爱德华氏菌的抑菌圈直径差异显著（P<0.05）;而盐度相同时不同中草药的抑菌效果同样差异显著（P<0.05）。其中，黄芩在各个盐度条件下对于迟缓爱德华氏菌的抑菌效果都较为明显，抑菌直径均>19.00 mm，而五倍子和石榴皮对于迟缓爱德华氏菌的抑菌效果随盐度的增加而增强，五倍子、诃子和黄芩在高盐度条件下抑菌效果显著高于其他2种药物（P<0.05），抑菌圈直径均>29.00 mm。

2.2 中草药对嗜水气单胞菌的抑菌圈直径

由表2可知，不同盐度下5种中草药原液对嗜水气单胞菌的抑菌圈直径差异显著（P<0.05）。其中，乌梅对于嗜水气单胞菌的抑菌效果最差，各个盐度下的抑菌圈直径均低于其他中草药。在盐度为0时，5种中草药对于嗜水气单胞菌的抑菌圈直径都较其他盐度条件下抑菌圈直径大，抑菌圈直径均 >19.00 mm，黄芩和乌梅这2种中草药在盐度1%～3%，抑菌强度随盐度增加而增强。

2.3 中草药水提物对迟缓爱德华氏菌的最小抑菌浓度

由表3可知，5种中草药水提物在不同盐度下，药物浓度越高抑菌效果越好。其中盐度为4%时，5种中草药的MIC较低，均≤25 mg/mL，抑菌效果较好;而盐度为1%和2%时，各中草药MIC均在25 mg/mL及以上，抑菌效果较差。

2.4 中草药水提物对嗜水气单胞菌的最小抑菌浓度

由表4可知，5种中草药水提物在不同盐度下，药物浓度越高抑菌效果越好。其中，乌梅和黄芩在高盐度条件下（盐度为3%、4%）MIC均≥25 mg/mL，抑菌效果较差，而五倍子、石榴皮和诃子在低盐度条件下（盐度为1%、2%）的MIC均≤25 mg/mL，抑菌效果较好，在盐度为0时，5种中草药对嗜水气单胞菌的MIC均≤25 mg/mL，其抑菌效果明显强于其他盐度。

3 讨论与结论

由本试验结果可知，在相同盐度条件下，5种中草药对迟缓爱德华氏菌和嗜水气单胞菌均有不同程度的抑制作用，其中黄芩和五倍子抑菌作用较强，诃子抑菌作用一般，而乌梅抑菌作用较差。石榴皮对于迟缓爱德华氏菌的抑菌效果一般，但对嗜水气单胞菌的抑菌效果特别明显。李权生等用纸片扩散法测定了9种抗生素和10种中草药对迟缓爱德华氏菌和嗜水气单胞菌等5种常见水产动物致病菌的抑菌效果，研究表明五倍子抑菌效果最好，黄芩次之[21]。其他研究证明，五倍子对于迟缓爱德华氏菌[22]和嗜水气单胞菌[23-24]均具有比较明显的抑制作用，本试验的结果与之基本一致，这可能与五倍子的药性有关，其富含鞣质，能够凝固微生物体内的原生质，同时含有多种酶，能够对多种细菌起抑制作用[25];黄芩的主要成分是黄芩苷，它具有非常广泛的抗菌谱[26]，如对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌以及沙门氏菌均具有十分良好的抑制作用，还具有很好的抗病毒作用[26]。

迟缓爱德华氏菌和嗜水气单胞菌均可在盐度0～4%环境下生长，故设定0、1%、2%、3%、4%共5个盐度梯度，比较5种中草药在这5个盐度梯度下的抑菌效果。盐度不同时，5种中草药对迟缓爱德华氏菌和嗜水气单胞菌的抑菌效果明显不同。在高盐度（盐度为3%、4%）时，5种中草药对于迟缓爱德华氏菌的MIC较低，均 ≤25 mg/mL，抑菌效果较好;而在低盐度（盐度为1%、2%）时，各个中草药的MIC均在 25 mg/mL 及以上，抑菌效果较差;在盐度为0时，5种中草药对迟缓爱德华氏菌的抑菌作用最弱，而盐度为4%时抑菌作用最强。由嗜水气单胞菌的抑菌效果可以看出，嗜水气单胞菌在盐度为0时，5种中草药对其的MIC最低，抑菌效果最好。马玉和等通过K-B纸片扩散法测得5种中草药对于迟缓爱德华氏菌和嗜水气单胞菌的体外抑菌效果，结果是5种中草药对迟缓爱德华氏菌在盐度为4%时抑菌效果最强，对嗜水气单胞菌的抑菌效果在盐度为0时最好[6]。本试验的研究结果与之基本一致，这可能与不同盐度下2种致病菌的活性不同有关。Ring等的研究表明，当北极鲑鱼在海水中养殖时，乳杆菌数量下降，而乳酸菌属细菌和链球菌属细菌的数量保持稳定[27];也有可能是因为中草药在不同盐度下的药性有所变化，关于这一点目前尚未得到论证，还需进一步研究。

五倍子、石榴皮、诃子、黄芩、乌梅对迟缓爱德华氏菌和嗜水气单胞菌均有不同程度的抑菌效果。盐度影响5种中草药对迟缓爱德华氏菌和嗜水气单胞菌的抑菌效果。高盐度时，5种中草药对于迟缓爱德华氏菌MIC较低，抑菌效果较好;而低盐度时，各个中草药MIC均在25 mg/mL及以上，抑菌效果较差。

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