膜分离技术精制罗汉果香味成分及应用

吴 彦，俞金伟，黄东业，马扩彦，曲利利，冉盼盼，孟丹丹，许春平*

1. 广西中烟工业有限责任公司技术中心，南宁市北湖南路28 号 530001

2. 郑州轻工业大学食品与生物工程学院，郑州高新技术开发区科学大道136 号 450001

3. 重庆中烟工业有限责任公司技术研发中心，重庆市南岸区南坪东路2 号 400060

罗汉果（Siraitia grosvenorii）为葫芦科罗汉果属植物，是我国特有的药用植物。罗汉果营养价值高，其干果富含蛋白质、多种氨基酸和维生素C；其味甘性凉，清甜醇香，被卫生部列为既是食品又是药品的产品［1］。目前，已有学者对罗汉果中的甜苷、罗汉果黄酮、块根药用成分［2-3］及其种仁油脂［4-5］进行了研究。郑小嘎等［6］采用索氏提取法制备罗汉果浸膏并进行卷烟加香试验，结果表明，罗汉果浸膏具有明显降低卷烟刺激性、柔和烟香、改善口感和增加烟气甜润度等效果。然而，提取的天然香料粗提物中不可避免地带有蛋白质、淀粉、蜡质等物质，这些大分子物质会对卷烟的感官品质产生不良影响［7-8］。

膜分离技术是一种选择性分离技术，可在分子水平上实现不同粒径分子混合物的分离［9］。王娜等［10］利用膜分离技术分离纯化桂花提取物，结果表明，膜分离技术可在保留桂花提取物原有特色香味的同时，有效去除对烟气感官质量有负面影响的大分子物质，从而达到提高桂花提取物品质的目的。杜锐等［11］研究了膜分离技术在提高再造烟叶品质方面的应用效果，结果表明：经过膜分离技术处理的烟梗、烟末萃取液中的总氮分别下降62.5%和67.8%；果胶基本去除；利用处理后的烟梗和烟末萃取液制备的再造烟叶的感官品质均有提升。目前，利用膜分离技术分离罗汉果浸膏制备烟用香料的研究鲜见报道。因此，采用索氏提取方法提取罗汉果天然成分，选用膜分离技术对制备的罗汉果浸膏进行分离、提纯，并将精制的天然香料组分添加到卷烟中，考察其加香效果；同时，采用GC/MS 分析各个组分的挥发性成分并进行主成分分析，再对膜分离组分加香的卷烟烟气粒相物中的挥发性成分进行分析，旨在为天然香料开发及卷烟加香应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

罗汉果（购自广西壮族自治区桂林市）；空白卷烟（广西中烟工业有限责任公司技术中心提供）。

无水乙醇（AR，天津市富宇化工有限公司）；内标：乙酸苯乙酯（色谱纯，美国Sigma-Aldrich公司）。

Q-100A3 高速多功能粉碎机（上海冰都电器有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）旋转蒸发仪（巩义市予华仪器有限责任公司）；陶瓷膜小型试验机、有机膜小型试验机（济南博纳生物技术有限公司）；Agilent 6890/5973 气 质 联 用 仪（GC/MS，美 国Agilent 公司）；RM20H 20孔道转盘型吸烟机（德国Borgwalt-KC公司）。

1.2 方法

1.2.1 罗汉果浸膏制备

根据预实验，准确称取100.00 g 罗汉果粉，用滤纸包好后装入索氏提取器，加入500 mL 无水乙醇，加热回流2 h；过滤，将滤液减压蒸馏至无乙醇流出，得到罗汉果浸膏23.74 g。

1.2.2 罗汉果浸膏膜分离及卷烟加香试验

准确称取10.00 g 罗汉果浸膏于1 000 mL 烧杯中，加入500 mL 20%乙醇；浸膏完全溶解后，进行膜分离实验（图1）。工艺流程：将未进行膜分离实验的组分记为M1；使用50 nm陶瓷膜去除固形颗粒杂质，截留组分记为M2，得到1.92 g组分；对透过液进行100 kDa 有机膜分离，截留组分记为M3，得到2.55 g组分；透过组分记为M4，得到1.69 g组分。

图1 膜分离实验工艺流程Fig.1 Process flow of membrane separation experiments

1.2.3 罗汉果浸膏膜分离组分烟丝加香试验

按照烟丝质量0.2 %的用量计算和称取组分，将称取的各组分用5 mL 70%乙醇溶解，然后均匀喷洒到烟丝上；将加香烟丝平衡，然后卷制成卷烟；将卷烟样品在温度22 ℃、相对湿度60%的环境条件下平衡48 h，然后进行感官评吸。

1.2.4 罗汉果浸膏膜分离组分中挥发性成分分析

准确称取M1～M4 组分各1.00 g 于分液漏斗中，分别加入20 mL 20%乙醇振荡溶解，待溶解完全后加入20 mL 二氯甲烷萃取24 h。取下清液，加入适量无水硫酸钠，静置过夜。过滤，将滤液浓缩至1 mL，以乙苯乙酯作为内标，进行GC/MS 分析。采用面积归一化法测定挥发性粒相物的释放量。GC/MS 条件为：

色谱柱：HP-5MS 毛细管柱（60 m×0.32 mm×0.25 μm）；进样口温度：250 ℃；程序升温：初始温度50 ℃，维持3 min，以4 ℃/min 升温至260 ℃，维持5 min；汽化温度：270 ℃；载气：He，1 mL/min；分流比：5∶1；电离方式：电子轰击（EI）；检测器温度：300 ℃；传输线温度：280 ℃；电离能量：70 eV；离子源温度：230 ℃；质量扫描范围：30～700 amu；检索谱库：NIST11 谱库。

1.2.5 罗汉果浸膏膜分离组分主成分分析

利用SPSS 软件进行主成分分析，根据相关系数列出相关矩阵，求出特征值及其相应的特征向量，从特征根中选出几个较大的特征值及其特征向量，使其累积贡献率在80%以上。

1.2.6 罗汉果浸膏膜分离组分卷烟加香验证

根据1.2.3 节感官评吸结果，进行卷烟加香试验。制备试验卷烟40 支和空白卷烟40 支，在温度（22±1）℃、相对湿度（60±2）%的环境条件下平衡48 h 后进行吸烟机抽吸实验。吸烟机实验条件：抽吸容量35 mL，抽吸持续时间2 s，抽吸间隔58 s。按照GB/T 19609—2004 标准的要求，用剑桥滤片捕集卷烟烟气粒相物，各收集40 支卷烟的粒相物。对剑桥滤片进行同时蒸馏萃取，采用GC/MS分析烟气粒相物中的挥发性成分，GC/MS 上样条件同1.2.4。将试验卷烟和空白卷烟的分析结果进行对比分析。

2 结果与讨论

2.1 膜分离组分卷烟加香感官评吸

膜分离组分的感官评吸结果见表1。可以看出，M3 组分的感官评吸结果最佳，能增加卷烟香气，使烟气柔和、刺激性减小，还可提高余味舒适度。M1 为醇提罗汉果浸膏，其中含有蛋白质、淀粉、蜡质等成分，这些成分会影响卷烟的感官品质；M2 是50 nm 陶瓷膜截留组分，其中也含有一定量的蛋白质、淀粉、蜡质等成分，因而也会影响加香效果；M3 是100 kDa 有机膜截留组分，其中的蛋白质、淀粉、蜡质等大分子物质已被前一步处理中使用的50 nm 陶瓷膜截留，而且香味物质含量丰富，因而其感官评吸效果最佳；M4 是100 kDa 有机膜透过组分，其中的香味物质量较少，因而其加香效果不佳。

表1 膜分离组分的感官评吸结果Tab.1 Sensory evaluation results of membrane separation components

2.2 膜分离组分挥发性成分分析

采用峰面积归一化法测定挥发性成分含量，4个组分中共检出43 种挥发性成分，结果见表2。由表2 可知：M1 中共检测出29 种挥发性成分，总量为3 573.66 μg/g，主要包括亚油酸、反式角鲨烯、5-羟甲基糠醛、油酸酰胺、棕榈酸等；M2 中共检测出18 种成分，总量为1 593.72 μg/g，主要包括5-羟甲基糠醛、亚油酸、油酸酰胺等；M3 中共检测出24种成分，总量为2 585.41 μg/g，主要包括金合欢醇、油酸酰胺、5-羟甲基糠醛、δ-杜松烯等；M4 中共检测出8 种成分，总量为954.51 μg/g，主要包括亚油酸、油酸酰胺、5-羟甲基糠醛等。

5-羟甲基糠醛具有似焦糖、谷物烘烤气息，有果香、面包香，可赋予卷烟木香、花香、果香和甜香；反式角鲨烯是烟叶中非色素的萜烯类物质，既能增进烟叶的香气和吸味，又可通过降解转化形成致香成分；金合欢醇［12］具有特有的铃兰花香气，并有青香和木香香韵，可赋予卷烟花香、青香和木香香韵；顺-β-金合欢烯具有青香、花香并伴有香脂香气。与M1 组分相比，除烷烃外，M2、M3、M4组分中挥发性成分的种类减少，含量也有不同程度的减少，这可能是由于膜吸附造成香味物质损失所致。与M1 组分相比，从M2、M3、M4 组分中检测出金合欢醇、2,4-二叔丁基苯酚、δ-杜松烯、顺-β-金合欢烯等成分，原因可能是M1 组分中物质种类较多，且这些物质与某些含量高的物质的保留时间相近，其色谱峰被高含量物质所掩盖，导致M1 中未检测出这些物质。

2.3 膜分离组分主成分分析

利用SPSS 软件对4 个组分中挥发性成分的相对含量进行主成分分析，得到主成分的特征值和特征向量（表3）。由表3 可知，第1 成分的贡献率为59.126%，第2 成分的贡献率为26.353%，前两个成分的累积贡献率已超过80%。可见，这两个主成分足以说明检测数据的变化趋势，因此根据其贡献大小将其分别命名为第1、第2 主成分。

表2 膜分离组分挥发性成分及含量①Tab.2 Volatile components and their contents in membrane separation components

表3 2 个主成分的贡献率Tab.3 Contributions of the two principal components

M1～M4 组分中检测出的43 种挥发性成分的主成分载荷矩阵如表4 所示。由表4 可知：第1 主成分反映的指标主要有棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、异丁香酚、反式角鲨烯、亚油酸甲酯、芥酸酰胺、亚油酸乙酯、棕榈酸乙酯、棕榈酸乙酯，十七烷、二十九烷、2,6,10,14-四甲基十六烷、2-乙酰基吡咯、环十二炔、亚麻酸乙酯、2-哌啶乙醇，指向酸类、酯类物质和烷烃；第2 主成分反映的指标主要有S-（Z）-3,7,11-三甲基-1,6,10-十二烷三烯-3-醇、α-法尼烯、（E,E）-3,7,11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯醛、二十一烷、二十六烷、二十八烷、二十三烷、（5 α）-4,4-二甲基-胆甾烷-3-酮、金合欢醇、δ-杜松烯、顺-β-金合欢烯、1-羟基-1,7-二甲基-4-异丙基-2,7-环癸二烯，指向烷烃和烯类物质。

表4 主成分载荷矩阵Tab.4 Principal component load matrix

根据表2 中4 个组分的43 种香气成分的相对含量，表3 中两个主成分的特征值，以及表4 中43种香气成分的载荷值，计算4 个组分的第1、第2 主成分值，然后以第1 主成分值为横坐标、第2 主成分值为纵坐标作散点图（图2）。由图2 可知，根据距离远近4 个组分可分为3 个区域，其中M2 组分与M4 组分接近，而M1 组分与M3 组分相距较远，即M2 组分和M4 组分的主成分有一定程度的相似性，而M1 和M3 组分的主成分差异较大。

图2 膜分离组分的主成分散点图Fig.2 Main component dispersion point diagram of membrane separation components

以43 种香气成分的第1 主成分值为横坐标、第2 主成分值为纵坐标作散点图，如图3 所示。结合图2 和图3 可知：影响M1 组分香气组成的挥发性成分主要集中在第1 主成分的正半轴和第2 主成分的负半轴，按影响力从大到小依次为亚油酸、反式角鲨烯、异丁香酚、DEHA 和亚油酸乙酯；影响M3 组分香气组成的挥发性成分主要集中在第1主成分的负半轴和第2 主成分的正半轴，按影响力从大到小依次为二十六烷、二十三烷、α-法尼烯、（E,E）-3,7,11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯醛、S-（Z）-3,7,11-三甲基-1,6,10-十二烷三烯-3-醇、二十一烷、油酸酰胺、二十四烷、六氢-3-（2-甲基丙基）-吡咯并［1,2-a］吡嗪-1,4-二酮和棕榈酰胺；影响M2 和M4 组分香气组成的挥发性成分主要集中在第1 主成分的负半轴和第2 主成分的负半轴，按影响力从大到小依次为4-戊基-1-（4-丙基环己基）-环己烯、硬脂酰胺、2,4-二叔丁基苯酚和二十烷。

2.4 膜分离组分加香后烟气粒相物挥发性成分分析

将M3 组分添加到卷烟中，作为实验组，分析其烟气粒相物挥发性成分并与对照组比对，选取匹配度大于80%的成分，结果如表5 所示。由表5可知，从空白对照组共检测出83 种成分，总量为16 764 μg/g；从实验组共检测出78 种成分，总量为17 427 μg/g。与对照组相比，添加M3 组分的实验组中烷烃和苯系化合物的种类及释放量均显著降低，这可能是因为在卷烟抽吸过程中M3 组分中的某些化学物质和这些物质发生化学反应生成其他化合物，进而导致烷烃和苯系化合物的释放量降低［13］。苯系化合物不仅影响卷烟感官质量，而且对人体健康有潜在的危害［14-16］。由此可知，M3 组分对提高卷烟安全性有积极作用。

对实验组和空白对照组挥发性成分进行进一步分析，结果显示，除烟碱、烷烃和苯系化合物外，空白对照组挥发性成分总量为9 676.09 μg/g，实验组挥发性成分总量为11 393.74 μg/g，挥发性成分总量增加1717.65 μg/g。烷烃物质总释放量降低164.56 μg/g，降幅高达84.4%；苯系化合物总释放量降低781.09 μg/g，降幅达到39.4%。实验组中释放量增加的挥发性成分有2,5-二甲基吲哚、香叶基香叶醇、二氢香芹醇、柠檬烯、香树烯、（+）-4-蒈烯等，这些成分对卷烟的香气和吸味均有积极作用。例如：2,5-二甲基吲哚可赋予卷烟烘烤气息；香叶基香叶醇是萜类成分、胡萝卜素等多种产物的前体；二氢香芹醇具有留兰香气、胡椒辛辣味；柠檬烯是单萜类化合物，具有类似柠檬的香味；香树烯和（+）-4-蒈烯是柏木油中主要的化学成分，具有柏木或檀香香气。

图3 43 种挥发性成分的主成分散点图Fig.3 Main component dispersion point diagram of 43 kinds of volatile components

表5 卷烟烟气粒相物挥发性成分检测结果对比①Tab.5 Comparison of detection results of volatile components in particulate matters of mainstream cigarette smoke

表5 （续）

表5 （续）

3 结论

①罗汉果浸膏经膜分离共分为M1、M2、M3、M4 四个组分，感官评吸结果表明，M3 组分的感官评吸效果最佳，烟丝中加入M3 组分后卷烟烟气更加柔和，刺激性降低，余味舒适。②经GC/MS 分析，从4 个组分共检测出43 种成分，其中某些成分如5-羟甲基糠醛、异丁香酚、反式角鲨烯、α-法尼烯、金合欢醇、顺-β-金合欢烯等为烟叶中重要的香气成分。③对4 个组分进行主成分分析，发现M3 组分与M1、M2、M4 有显著差异；M2 和M4 组分的香味成分无显著差异。M3 组分中的香气成分主要有二十六烷、二十三烷、α-法尼烯、（E,E）-3,7,11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯醛、S-（Z）-3,7,11-三甲基-1,6,10-十二烷三烯-3-醇、二十一烷、油酸酰胺、二十四烷、六氢-3-（2-甲基丙基）-吡咯并［1,2-a］吡嗪-1,4-二酮和棕榈酰胺等。④利用吸烟机收集试验卷烟烟气粒相物，挥发性成分检测结果表明，M3 组分使卷烟烟气粒相物中苯系化合物的释放量降低，这对卷烟的安全性有积极作用。