VB6代谢途径相关基因在苹果苦痘病果实中的表达

刘连妹 屈海泳 安爽 郝传浩 任翠萍

摘要：以贮藏期为0 d的富士苹果（Malus pumila）发病果实与未发病果实为试验材料，通过高通量测序、果肉RNA提取、cDNA反转录、荧光定量PCR等技术，研究了正常果实（CK）、发病果实未发病部位（BC）和发病果实发病部位（BP）果肉中与VB6代谢途径相关基因的表达情况。结果表明，VB6代谢途径相关基因在CK、BC和BP间的相对表达量存在差异，且在BP中显著上调（P<0.05）。由此认为，VB6代谢途径与苹果苦痘病有关，且基因表达上调。

关键词：苹果（Malus pumila）;苦痘病;VB6代谢途径

中图分类号：Q78;S432         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2019）12-0147-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.12.034           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract： In this study， the diseased fruit and non-pathogenic fruit of Fuji apple with a storage period of 0 days were used as control materials. The expression of genes related to VB6 metabolic pathway in normal fruit （CK）， diseased fruit non-diseased parts （BC） and diseased fruit diseased parts （BP） was studied by High-throughput sequencing， extraction of pulp RNA， cdna reverse transcription and fluorescence quantitative PCR techniques， and the differences among them were compared. After experiments， the results showed that the relative expression levels of genes related to VB6 metabolic pathway in CK， BC and BP were different， and they were significantly upregulated in BP. Thus， the VB6 metabolic pathway is associated with apple bitter pit disease and gene expression is upregulated. Therefore， for the follow-up study of apple and other diseases such as bitter pit disease， we can start from the breakthrough of the VB6 metabolic pathway molecule.

Key words： apple（Malus pumila）; bitter pit disease; VB6 metabolic pathway

蘋果（Malus pumila）果实营养丰富，富含矿物质和维生素，其营养成分可溶性大，容易被人体吸收，因此被人们所喜爱。中国已经成为全世界范围内苹果的最大生产国以及消费国，并且栽培面积和产量也在不断扩大，但在苹果栽培与生理代谢方面，苦痘病等病害导致果实的果品质量和外观品质下降，严重影响苹果的经济价值[1，2]，阻碍了苹果产业的健康发展。

苹果苦痘病又可称为苦陷病，其经常在果实接近成熟的时候开始出现病症，延续于贮藏期，主要表现在果实上，是当前十分棘手的一种苹果的生理性病害。诱发苹果苦痘病的因素较多，包括品种特性、果园的土肥水管理、树体的营养养分、砧木种类、树龄、树势、修剪时期、树体负载量、果实的着生部位、果实大小、种子数量、采收时期以及贮藏环境等因素[3]。在品种特性上，对苹果的果实苦痘病和果实钙含量的遗传变异进行研究[4]，发现大多数的苹果对苦痘病免疫率很低。在栽培生产上有许多易感苦痘病的品种，包括金冠、红元帅、新红星、澳洲青苹、Gravenstein等[5]。在Ca2+研究方面，缺钙会引起苹果苦痘病的发生，在总钙含量方面为不发病的果实与发病果实相比要高30%，钙调蛋白含量比正常果高40%[6]，说明钙-钙调蛋白系统可能参与了苦痘病的发生。在栽培措施上，对苹果进行套袋也会在一定程度上加重苦痘病的发生。套袋主要是影响苹果生长发育的微环境，纸袋降低了果实生长发育的蒸腾速率，从而改变了果实微环境中的温度以及湿度[7，8]，从而导致果实的总钙浓度、HCl-Ca、HOAC-Ca和NaCl-Ca 3种组分的含量减少，使得苹果套袋后苦痘病加重[9]。

VB6是一类吡啶衍生物的总称，包括吡哆醇、吡哆胺、吡哆醛、磷酸吡哆醇、磷酸吡哆胺和磷酸吡哆醛[10]。它能够作为生长调节剂促进植物体的生长发育，主要形式包括PLP和PMP，可以作为多种酶的辅酶，参加各种催化氨基酸的一系列反应[11]。近几年的研究也发现，VB6代谢途径中的PLP能够调节植物体内K+浓度[12-14]，K+与苹果苦痘病又有相关联系，所以猜测VB6代谢途径与苹果苦痘病有关，代谢途径中部分相关基因可以调控苹果苦痘病等生理性病害，所以本研究从VB6代谢途径相关基因入手寻找其中与苦痘病相关的基因，以期从分子技术层面为防治苦痘病的发生开辟新的途径。

1  材料与方法

1.1  材料

试验材料10月采摘于莱西良种场，贮藏期为0 d的正常富士苹果和苦痘病发病苹果。

1.2  主要仪器

超低温冰箱，涡旋仪，冷冻离心机，SMA4000型微量分光光度计，微型离心机，荧光定量PCR仪等。

1.3  主要试剂

TIANGEN公司RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（离心柱型），β-巯基乙醇，无水乙醇，罗氏反转录试剂盒，ROX SYBR等。

1.4  qRT-PCR引物

引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列见表1。

1.5  方法

1.5.1  差异基因的筛选  对正常果肉（CK）、发病果实正常部位果肉（BC）和发病果实病斑区域果肉（BP）进行高通量测序。测序结果显示，VB6代谢途径相关基因表达差异显著，所以选取了LOC762、LOC012、LOC273、LOC606、LOC086、LOC777、LOC472、

LOC787、LOC549等9个基因。

1.5.2  材料处理  将苹果用自来水冲洗干净，再用去离子水冲洗，最后用超纯水清洗，自然晾干。在冰盒中倒入液氮，削取正常果实果肉（CK）、发病果实正常部位果肉（BC）、发病果实病斑区域果肉（BP），迅速置于液氮中。削取结束后，将样品迅速从液氮中取出分装于自封袋中，标记好样品名称、时间等。

1.5.3  果肉RNA的提取  果肉RNA的提取使用TIANGEN公司RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（离心柱型），试验操作过程均在4 ℃冰盒上进行。

SMA4000型微量分光光度计测定所得到的RNA溶液浓度。选取了OD260 nm/OD280 nm在1.8～2.1之间的RNA样品，结果见表2。

1.5.4  苹果果肉RNA的反转录  第一链cDNA反转录使用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒进行，将前面提取到的样品RNA进行反转录，所有反应均在4 ℃冰盒中进行。

1.5.5  实时荧光定量PCR  采用SYBR方法进行实时荧光定量PCR扩增反应，选用了Light Cycler R480 SYBR GreenⅠMaster试剂盒进行操作。采用了SYBR的方法进行两步法qRT-PCR的扩增反应，qRT-PCR反应体系见表3。

1.5.6  数据分析  利用实时定量RT-PCR所获得的数据进行分析，以苹果的Actin作为内参基因[15]，按照2-ΔΔCT法来计算9个基因的相对表达量，应用Microsoft Excel软件进行数据分析，比较9个基因在CK、BP、BC果肉中的相对表达量，用DPS作显著性差异分析。

2  结果与分析

2.1  LOC762基因在富士苹果果肉中的相对表达量

LOC762基因在富士苹果正常果实（CK）、发病果实未发病部位（BC）和发病果实发病部位（BP）果肉中的相对表达量存在差异。从图1可以看出， LOC762基因在发病果实未发病部位（BC）中的相对表达量相为1.82，显著高于正常果实（CK）相对表达量1.05（P<0.05），而发病果实发病部位（BP）的相对表达量为6.43，显著高于CK和BC的相对表达量（P<0.05）。说明LOC762基因在发病果实未发病部位（BC）和发病果实发病部位（BP）中均起到显著上调的作用。

2.2  LOC012基因在富士苹果果肉中的相对表达量

从图2可以看出， LOC012基因在发病果实未发病部位（BC）中的相对表达量为5.57，高于正常果实（CK）相对表达量3.55，而发病果实发病部位（BP）的相对表达量为74.76，极显著高于CK和BC的相对表达量（P<0.01）。由此可见，LOC012基因在苹果苦痘病果实中起到上调作用，尤其是在BP果肉中极显著上调。

2.3  LOC273基因在富士苹果果肉中的相对表达量

从图3可以看出，LOC273基因在发病果实未发病部位（BC）中的相对表达量为0.58，低于正常果实（CK）表达量1.11，但差异不显著，而发病果实发病部位（BP）的相对表达量为2.49，极显著高于CK和BC的相对表达量（P<0.01）。由此可见，LOC273基因在BC中没有起到上调的作用，在BP中起到了极显著上调的作用。

2.4  LOC606基因在富士苹果果肉中的相对表达量

从图4可以看出，LOC606基因在发病果实未发病部位（BC）的相对表达量为0.25，低于在正常果实（CK）果肉中的相对表达量1.13，在发病果实发病部位（BP）的相对表达量为2.28，高于CK，极显著高于BC的相对表达量（P<0.01）。因此，LOC606基因在苦痘病果实BP起到极显著上调作用，而在BC中没有上调，在CK和BC之间的表达差异不明显。

2.5  LOC086基因在富士蘋果果肉中的相对表达量

从图5可以看出，LOC086基因在发病果实未发病部位（BC）中的相对表达量为6.43，显著高于正常果实（CK）相对表达量1.11（P<0.05），而发病果实发病部位（BP）的相对表达量为78.63，极显著高于正常果实（CK）和发病果实未发病部位（BC）的相对表达量（P<0.01）。虽BC暂未发病，但LOC086基因在BC中依然起到了上调的作用， 而在BP中则起到了极显著上调作用。

2.6  LOC777基因在富士苹果果肉中的相对表达量

从图6可以看出， LOC777基因在发病果实未发病部位（BC）中的相对表达量为0.49，略低于正常果实（CK）表达量1.09，而发病果实发病部位（BP）的相对表达量为2.06，显著高于CK和BC的相对表达量（P<0.05）。可见，LOC777在BC中并未起到上调作用，但BC与CK差异不显著，而LOC777基因在BP中則起到了上调作用，且差异显著。

2.7  LOC472基因在富士苹果果肉中的相对表达量

从图7可以看出，LOC472基因在发病果实未发病部位（BC）中的相对表达量为0.74，略低于正常果实（CK）相对表达量1.03，但差异不显著，而发病果实发病部位（BP）的相对表达量显著高于正常果实（CK）和发病果实未发病部位（BC）的相对表达量（P<0.05），说明LOC472基因在BP中起到显著上调作用。

2.8  LOC787基因在富士苹果果肉中的相对表达量

从图8可以看出，基因LOC787在发病果实未发病部位（BC）中的相对表达量为0.89，低于正常果实（CK）表达量1.20，差异不显著，而发病果实发病部位（BP）的相对表达量为2.10，显著高于CK和BC的相对表达量（P<0.05）。由此说明，LOC787基因的表达量在苦痘病果实BP中显著上调。

2.9  LOC549基因在富士苹果果肉中的相对表达量

从图9可以看出，LOC549基因在发病果实未发病部位（BC）中的相对表达量为2.67，显著高于正常果实（CK）相对表达量为1.06（P<0.05），而发病果实发病部位（BP）的相对表达量为6.81，显著高于CK和BC的相对表达量（P<0.05）。因此， LOC549基因在BC和BP中的表达均为显著上调。

通过对9个基因在富士苹果正常果实（CK）、发病果实未发病部位（BC）和发病果实发病部位（BP）表达情况进行分析，结果发现，VB6代谢途径的9个基因在CK、BC和BP的相对表达量均存在差异。其中，LOC762、LOC012、LOC086和LOC549在 BC和BP中均起到了上调作用;LOC273、LOC606、LOC777、LOC472和LOC787只在BP上调，在BC没有起到上调作用，但CK与BC间的表达并无显著差异。由此，推测VB6代谢途径与苹果苦痘病相关，且基因表达上调。

3  小结与讨论

近几年来，国内外研究学者已经对苹果苦痘病防治进行了大量研究。对于易发苦痘病的果园，通过控制树势，适当提高果实的负载量、降低果实的大小等措施，对于预防苦痘病的发生都是有一定作用的[16]。果实发育期内降低过高的GA水平可能在一定程度上能够控制缺钙引起的苦痘病等生理病害[17]。邢文曦[18]通过采用高通量转录组测序，从苦痘病未发病的果实和苦痘病发病的果实中寻找与苦痘病发病的相关基因，从而为进一步的研究奠定分子研究的基础。

本研究将富士苹果CK、BC和BP果肉中VB6代谢途径的9个相关基因的表达进行了对比分析。结果显示，VB6代谢途径的9个相关基因的表达量在CK、BC和BP果肉中存在显著差异，且在果实发病部位（BP）显著上调。由此推测，VB6代谢途径这些基因可能影响苹果苦痘病的发病情况，但是其中的反应机理还有待研究。前人研究显示，PLP→PL→PN是植物体内VB6代谢转换的主体方向[10]。从植物VB6代谢途径入手研究，可以从分子方面研究VB6代谢其他相关基因在苹果苦痘病中的表达影响，也可从VB6代谢生理机制方面作进一步的研究，从而为防治苦痘病提供新思路、新途径。

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收稿日期：2019-04-02

作者简介：刘连妹（1973-），女，河北衡水人，讲师，硕士，主要从事果树生理学研究，