枇杷叶不同成分抗氧化和止咳祛痰活性研究

黄素华 陈彤 邱丰艳 洪燕萍

摘要：采用分光光度法测定枇杷[Eriobotrya japonica （Thunb.） Lindl.]叶提取物中的黄酮、多酚、总萜及其含量;采用DPPH和FRAP法检测其抗氧化活性;采用氨水引咳法和气管酚红排泌法研究其止咳祛痰活性，并分析其成分与抗氧化、止咳祛痰活性的相关性。结果表明，6种枇杷叶提取物均具有抗氧化活性，其中黄酮抗氧化活性显著高于三萜酸，多糖抗氧化活性较差，提取物的抗氧化活性与黄酮和多酚含量显著相关;6种提取物均具有止咳祛痰活性，黄酮和三萜酸的效果相近，多糖较差，成分含量与活性相关性分析显示，黄酮能减少咳嗽次数，总萜能延长咳嗽潜伏期，且有一定的祛痰作用。枇杷叶中黄酮、多酚可能是抗氧化的重要成分，黄酮与止咳祛痰活性相关，通过精制富集有效成分，能提高相关活性。

关键词：枇杷[Eriobotrya japonica （Thunb.） Lindl.]叶提取物;抗氧化;止咳祛痰;黄酮;多酚;总萜;相性

中图分类号：S667.3         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2019）12-0138-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.12.032           開放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract： Determination of flavonoid， polyphenol， total terpene and their contents in loquat[Eriobotrya japonica （Thunb.） Lindl.] leaf extracts by spectrophotometry， DPPH and FRAP method were used to determine the antioxidant activity， cough model induced by ammonia liquor in mice to observe the antitussive effects，the method of phenol red execretion in mice was used to investigate expectorant effects，and the correlation of composition and the activity were analyzed. Results showed that the loquat leaf extracts had certain antioxidant activity， the flavonoids were significant better than triterpenoid acid， the polysaccharides were weaker， and the antioxidant activity related to the content of flavonoids and total polyphenols. All the 6 kinds of loquat leaf extract had certain antitussis and expectorant activity， the flavonoids and triterpenoid acid were better than the polysaccharides， the times of cough and the content of flavonoid showed significantly negative correlation， the saponins had certain dosage-effect relation with prolonged the incubation period of cough and expectorable activity. The extracts of loquat leaf had antioxidation and antitussis and expectorant activity， flavonoids and polyphenols could be important part of the antioxidant component， flavonoids and saponins were associated with antitussis and expectorant activity. Through the refined， the effective components can be enriched and the relevant activity can be improved.

Key words： extract of loquat [Eriobotrya japonica （Thunb.） Lindl.] leaves; antioxidant activity; antitussive and expectorant activity; flavonoids; polyphenol; total terpene; correlation

枇杷[Eriobotrya japonica （Thunb.） Lindl.]属于蔷薇科植物，在中国有2 200多年的栽培历史[1]。其药用价值始载于《名医别录》，是常见的中药材。枇杷叶中的化学成分结构多样，主要有三萜酸类、倍半萜类、多酚类、黄酮类以及糖苷类化合物[2]。三萜酸类成分因其功效显著而备受重视，许多研究表明枇杷叶三萜酸具有抗炎、镇咳、抗癌、调节血糖、抗抑郁、保肝护肝等作用[3，4]。枇杷叶黄酮类成分具有抗氧化、抗炎、抗癌、保肝护肝等功能[5，6]。何玉琴[7]研究了枇杷叶黄酮提取物的功效，结果显示提取物对鸡传染性支气管炎病毒（IBV）感染的雏鸡肝功能及肾功能有显著保护作用，能提高IBV抗体水平，同时能提高雏鸡的生长性能和免疫指标。枇杷叶多糖在抗氧化[5，8]和抗疲劳上有一定功效[9]。枇杷叶提取物具有很好的抗氧化和止咳作用[10]，但具体是哪类成分起主要作用并不确定。本研究以6种纯化前、后的枇杷叶提取物黄酮、三萜酸、多糖为材料，研究其止咳祛痰和抗氧化活性及其活性与黄酮、总酚、皂苷含量的相关性，为枇杷叶的进一步应用提供理论基础。

1  材料与方法

1.1  材料

6种提取物：精制黄酮、粗黄酮、精制三萜酸、粗三萜酸、精制多糖、粗多糖。

枇杷叶经醇提浓缩，去醇加水，获沉淀及上清液两部分，分别富含三萜酸和黄酮，称粗三萜酸和粗黄酮，并经不同纯化过程得到精制三萜酸和精制黄酮[11]。醇提后枇杷叶滤渣，经水提醇沉得到粗多糖，经大孔树脂纯化得到精制多糖[5]。

1.2  方法

1.2.1  含量测定  以芦丁为标准品，采用亚硝酸钠-硝酸铝法测定黄酮含量;以熊果酸为标准品，采用香草醛-高氯酸显色法测定总萜含量;以没食子酸为标准品，采用Folin-ciocalteu方法测定总酚含量[12]。

1.2.2  枇杷叶提取物抗氧化活性测定

1）自由基清除能力的测定——DPPH法。6种提取物溶解稀释成不同浓度，取稀释液20 μL，加1.98 mL DPPH无水乙醇溶液反应30 min，测定517 nm处的OD值，计算DPPH自由基清除率，以反应体系中提取物含量（μg/g）为X轴，以自由基清除率为Y轴作图，根据清除率线性回归曲线计算EC50，EC50越低，自由基清除能力越大[12]。

2）总还原能力的测定——FRAP法。0.2 mL不同浓度FeSO4加1.8 mL TPTZ工作液，37 ℃反应10 min，593 nm测定吸光度并绘制标准曲线。6种枇杷叶提取物溶解稀释成适当浓度，取稀释液0.2 mL加1.8 mL TPTZ工作液，37 ℃反应10 min，测定593 nm处OD值。根据吸光度的大小计算样品总还原能力[13]。

1.2.3  枇杷叶提取物的止咳、化痰活性  取清洁级雄性昆明小鼠120只，体重22±2 g，随机分成8组，为阴性对照组（生理盐水）、阳性对照组（体积分数为0.2%氯化铵）及枇杷叶提取物试验组，每组15个重复，采用氨水引咳法和气管酚红排泌法研究提取物的止咳和祛痰活性[10]。

氨水引咳法。枇杷叶提取物组（0.04 g/mL）灌胃剂量为0.05 mL/10 g小鼠，阴性对照组和阳性对照组灌胃剂量为0.1 mL/10 g小鼠，每天分别灌胃，连续10 d，各组末次给药1 h后，将小鼠置于倒扣的1 L烧杯内。吸取体积分数25%～28%氨水0.5 mL注入棉球上，再放入烧杯内。观察并记录小鼠咳嗽的潜伏期及3 min内的咳嗽次数。

气管段酚红排泌法。小鼠灌胃给药与止咳试验一致，各组末次给药1 h后，腹腔注射体积分数0.5%的酚红0.5 mL（小鼠体重约35±2.6 g）。0.5 h后处死小鼠，剪下一段气管，放入盛有2 mL生理盐水的试管中，再加入1 mol/L NaOH 0.1 mL，避光放置30 min后，用紫外可见分光光度计于波长546 nm處测定OD值。

2  结果与分析

2.1  6种枇杷叶提取物中黄酮、总酚、总萜含量及抗氧化活性

2.1.1  6种枇杷叶提取物中黄酮、总酚、总萜含量及DPPH（EC50）、FRAP值  由表1中FRAP值可知，6种枇杷叶提取物抗氧化活性强弱依次为精制黄酮>粗黄酮>粗三萜酸>精制三萜酸>粗多糖>精制多糖，黄酮提取物的抗氧化活性较三萜酸提取物高，多糖提取物抗氧化活性较差。样品黄酮纯化后黄酮、总酚、总萜含量均极显著提高，FRAP值也极显著提高，DPPH值降低，表明黄酮纯化后成分含量升高，抗氧化能力提高;样品三萜酸纯化后总萜含量极显著升高，总酚含量极显著降低，FRAP值极显著下降，表明三萜酸纯化杂质减少，抗氧化能力下降;样品多糖纯化后黄酮、总酚和总萜含量极显著降低，FRAP值极显著下降，DPPH值降低，表明多糖纯化后黄酮多酚含量下降导致总还原能力下降，但清除自由基能力反而上升，可能多糖具有一定的自由基清除能力。

许多植物的药用活性与其抗氧化活性密切相关[14]。黄酮、总酚是自然界存在的天然抗氧化成分，许多植物的抗氧化活性与黄酮、总酚含量有关[15，16]。枇杷叶中富含黄酮成分，抗氧化活性是最主要的生物活性，样品黄酮纯化后黄酮含量极显著提高，因此抗氧化能力提高。三萜酸及多糖纯化后，总酚含量减少，总还原能力下降。

2.1.2  抗氧化能力与黄酮、总酚含量的相关关系  通常认为黄酮、总酚是较好的抗氧化物质，因此在测定黄酮、总酚、总萜含量及DPPH自由基清除能力与FRAP法测定的总还原能力的基础上，分别对黄酮含量、总酚含量、黄酮与总酚的总含量、总萜含量与DPPH自由基清除能力（EC50）及总还原能力（FRAP法）之间进行线性回归分析，判定它们之间是否存在相关关系。相关性分析结果显示，黄酮含量与FRAP值呈极显著相关，多酚含量与FRAP值呈显著相关，说明枇杷叶提取物中黄酮和多酚可能为主要抗氧化活性物质。

2.2  6种枇杷叶提取物止咳祛痰活性研究

2.2.1  6种枇杷叶提取物止咳祛痰活性测定结果  由表2可见，给药组和阴性对照生理盐水比较，在延长咳嗽潜伏期方面，除粗多糖与对照无显著差异外，其他枇杷叶提取物与阴性对照差异显著，其中黄酮提取物和三萜酸提取物的止咳祛痰效果相近，多糖提取物效果较差;在减少咳嗽次数方面，各种提取物效果均显著高于阴性对照，其中黄酮提取物效果较好。总体而言，枇杷叶提取物具有止咳作用，黄酮提取物效果较好。给药组和阴性对照比较，除粗多糖、粗三萜酸提取物外，其他提取物均显著促进小鼠呼吸道酚红的排泌量，其中精制三萜酸和精制黄酮效果相近，其次为粗黄酮，说明枇杷叶提取物具有祛痰作用，黄酮和三萜酸提取物均有较好的祛痰效果。

提取物纯化前后活性比较显示，黄酮纯化后咳嗽潜伏期显著延长，咳嗽次数有一定下降，酚红排泌量有一定升高，说明黄酮纯化后止咳祛痰活性升高;三萜酸纯化后潜伏期显著延长，咳嗽次数没有差异，酚红排泌量显著升高，说明纯化后止咳祛痰活性升高;多糖纯化后潜伏期显著延长，咳嗽次数有所下降，酚红排泌量显著升高，说明纯化后止咳祛痰活性升高。3类成分经过纯化后活性成分含量升高，止咳祛痰活性也相应有所升高。

2.2.2  6种枇杷叶提取物止咳祛痰活性与黄酮、总萜含量的相关性分析  对小鼠咳嗽次数、咳嗽潜伏期、酚红浓度与枇杷叶提取物中黄酮、总酚和总萜含量进行相关性分析，结果显示黄酮与咳嗽次数显著相关，总萜与咳嗽潜伏期显著相关，此外，相关性分析还显示咳嗽潜伏期与酚红浓度显著相关，推测总萜与酚红浓度应存在一定的相关性。相关性分析结果说明，黄酮能减少咳嗽次数，总萜能延长咳嗽潜伏期，且两者均有一定的祛痰作用。

3  小结

枇杷叶黄酮提取物、三萜酸提取物的抗氧化活性较高，多糖提取物抗氧化活性较差。黄酮、总酚含量均与FRAP法测定的氧化还原能力正相关，与DPPH的EC50值负相关，即与DPPH自由基清除能力正相关。总萜含量与FRAP法测定的氧化还原能力、DPPH自由基清除能力无相关关系。总萜含量与黄酮含量有极显著相关关系，与总酚含量无显著相关关系。试验数据结果表明，黄酮、总酚有较强的抗氧化活性，而总萜没有强的抗氧化活性。

在止咳、化痰方面，枇杷叶提取物中黄酮、三萜酸等具有较好的作用，精制黄酮、精制三萜酸效果好于阳性对照0.2%氯化铵。其中黄酮能减少咳嗽次数，总萜能延长咳嗽潜伏期，且两者均有一定的祛痰作用。提取物通过精制，能富集有效成分，提高枇杷叶提取物的抗氧化活性和止咳祛痰活性。从试验结果可以推断，枇杷叶提取物中黄酮、多酚类成分是抗氧化的主要成分，止咳化痰作用的主要成分除了三萜酸类之外，黄酮类成分也有同样的重要作用，由于黄酮类成分水溶性好，药效更容易发挥，而三萜酸类成分的水溶性差，在实际使用中作用可能难以发挥，要想提高其功效应该想办法提高其溶解度。枇杷叶多糖类成分不是止咳和抗氧化的主要成分。综合来看要提取枇杷叶的功效成分，用常规的水煎煮应该不是好的办法，要充分发挥枇杷叶的功效，应该有针对性地提取纯化，采用一定的手段加工成一定的制剂，提高其药效。

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收稿日期：2018-06-29

作者简介：黄素华（1968-），女，福建龙岩人，副教授，硕士，主要从事天然活性物质、植物生物技术研究，