冠心平对动脉粥样硬化ApoE-/-小鼠ox-LDL、LoX-1蛋白及mRNA、ICAM-1、ELAM-1水平的影响

黄雪云 李七一 严士海 朱波

(1淮安市中医院心内科，江苏 淮安 223001；2江苏省中医院心内科)

随着我国人民生活水平提高和饮食习惯改变，由动脉粥样硬化(AS)导致的心血管疾病已成为我国人口主要死亡原因之一。研究表明，炎性反应在AS发生发展过程中起着重要作用〔1〕。冠心平是江苏省中医院治疗冠心病的院内制剂，主要由黄精、当归、三七、瓜蒌皮、甘松组成。临床观察显示，冠心平具有保护冠心病AS血管内皮细胞、抑制炎症反应、抗氧化与抗纤维化等多靶点的治疗作用，疗效显著〔2～4〕。本研究通过观察冠心平对AS模型ApoE-/-小鼠血清氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)、氧化型低密度脂蛋白受体(LoX)-1蛋白及mRNA、细胞间黏附分子(ICAM)-1、内皮细胞白细胞黏附分子(ELAM)-1水平的影响，探讨该药对AS的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 16只C57BL/6J ApoE-/-小鼠，体重20～22 g，雄性，北京大学医学部实验动物科学部提供，动物合格证号：SCXK(京)2006-0008。

1.2 主要试剂和仪器 冠心平(江苏省中医院制备，批号：110802)；阿托伐他汀钙片(辉瑞制药有限公司，批号：1105113)；苯磺酸氨氯地平(辉瑞制药有限公司，批号：1105113)；全蛋白抽提试剂盒、Braford蛋白含量检测试剂盒、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝脉电泳(SDS-PAGE)配制试剂盒均购自南京凯基生物科技发展有限公司；ELAM-1，abcam公司，货号：AB18981；ICAM-1，Santa Cruz公司，货号：Sc-8439。752分光光度计(上海分析仪器厂)；紫外分光光度仪(UV-2450，SHIMADZU)；核酸电泳仪(DYY-6B，北京六一仪器)；凝胶成像仪(GelDocXR，BIO-RAD)。

1.3 AS模型建立及给药 取ApoE-/-小鼠13只，予高脂饲料(78%基础饲料、10%蛋黄粉、2%胆固醇、10%猪油)，同时取3只ApoE-/-小鼠作为正常组(喂养基础饲料)，喂养12 w后，各取1只断颈处死。解剖取出主动脉，10%甲醛固定、石蜡包埋、切片、HE染色，如显微镜下观察主动脉壁内膜有斑块形成，则造模成功。将余下的小鼠分为模型组(蒸馏水灌胃)、阿托伐他汀(6.67 mg/kg)组、苯磺酸氨氯地平(1.67 mg/kg)组、冠心平低剂量(0.75 g/kg)组、冠心平高剂量(1.50 g/kg)组，每组6只，药物溶解于蒸馏水中灌胃，0.1 ml/10 g体重，1次/d。喂养3个月后，于末次给药1 h后眼眶采血，分离血清，-20℃保存；液氮保存主动脉，备用。

1.4 各组ox-LDL、ELAM-1、ICAM-1、LoX-1蛋白及LoX-1 mRNA水平检测 采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清中ox-LDL浓度，按照试剂盒说明进行操作。采用Western印迹法测定ELAM-1、ICAM-1、LoX-1蛋白表达水平：用抽提试剂盒提取血管组织中总蛋白，蛋白样品处理后，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，转膜，染色，封闭，分别加入一抗、二抗孵育，加发光液，显色，扫描条带，保存目的条带，应用图像分析仪对条带做扫描半定量。聚合酶链反应(PCR)检测LoX-1 mRNA水平：用全蛋白抽提试剂盒提取血管组织中的总RNA，取5 μg用于逆转录生成cDNA，取1 μl cDNA用于PCR,以β-actin作为内参，引物序列：β-actin正义引物:5′-GCCAACCGTGAAAAGATG-3′,反义引物:5′-AGAAGGAAGGCTGGAAAA-3′，产物条带：460 bp；LoX-1正义引物:5′-TTAAGACCAGGGGCGT-3′，反义引物:5′-TGATGAGGTGAACTGTAGC-3′，产物条带：581 bp。

1.5 统计学分析 采用SPSS15.0软件行t或χ2分析。

2 结 果

2.1 各组血清ox-LDL水平 模型组血清ox-LDL的含量〔(5.71±1.27)μg/ml〕较正常组明显升高〔(1.24±0.44)μg/ml，P<0.01〕；阿托伐他汀组、氨氯地平组、冠心平高剂量组血清ox-LDL的含量〔分别为(3.19±1.19)、(4.13±0.72)、(5.56±0.93)μg/ml〕较模型组明显降低(均P<0.01)，冠心平低剂量组ox-LDL水平〔(2.88±1.12)μg/ml〕与正常组比较无显著差异(P>0.05)。

2.2 各组血管组织中LoX-1表达水平 模型组主动脉组织中LoX-1的含量明显高于正常组(P<0.01)。阿托伐他汀、氨氯地平和高、低剂量冠心平组LoX-1含量均较模型组显著降低(P<0.05，P<0.01)；高剂量冠心平组作用优于阿托伐他汀、氨氯地平组(均P<0.05)。见图1。

1～6分别为：正常组、模型组、阿托伐他汀组、氨氯地平组、冠心平低剂量组、冠心平高剂量组；与正常组比较：1)P<0.05，与模型组比较：2)P<0.05，3)P<0.01；下图同图1 各组血管组织中LoX-1表达水平

2.3 各组血管组织中LoX-1 mRNA表达水平 模型组LoX-1 mRNA含量明显高于正常组(P<0.01)。阿托伐他汀、氨氯地平和高剂量冠心平组LoX-1 mRNA含量均较模型组明显降低(P<0.01)。见图2。

图2 各组血管组织中LoX-1 mRNA表达水平

2.4 各组血管组织中ICAM-1表达水平 模型组ICAM-1含量明显高于正常组(P<0.01)。高剂量冠心平组和阿托伐他汀组ICAM-1含量明显低于模型组(P<0.01)。见图3。

图3 各组血管组织中ICAM-1表达水平

2.5 各组血管组织中ELAM-1表达水平 模型组ELAM-1含量明显高于正常组(P<0.01)。高剂量冠心平组、阿托伐他汀组、氨氯地平组ELAM-1含量明显低于模型组(P<0.01)。见图4。

图4 各组血管组织中ELAM-1表达水平

3 讨 论

低密度脂蛋白(LDL)被动脉壁细胞氧化修饰形成ox-LDL，ox-LDL能上调单核细胞趋化蛋白-1及巨噬细胞刺激因子的基因表达，使单核细胞进入动脉壁，分化成为巨噬细胞，表达清道夫受体；ox-LDL被巨噬细胞的清道夫受体识别并快速摄取，导致巨噬细胞内大量胆固醇脂质颗粒蓄积，最终形成泡沫细胞〔5〕。

此外，ox-LDL还可诱导平滑肌细胞摄取ox-LDL，继而产生平滑肌源性泡沫细胞；同时促进巨噬细胞分泌多种细胞因子和生长因子，引起内皮细胞黏附蛋白的表达，从而导致炎症的进一步发展及促进AS的形成。ox-LDL在内皮细胞中的主要受体是LoX-1，其能介导内皮细胞对细胞毒性ox-LDL的摄取，与AS的启动及发生发展相关联〔6〕。LoX-1 mRNA表达水平与外周血胆固醇、LDL、动脉硬化指数、血脂比值及腹主动脉内膜斑块面积呈正相关〔7〕。本实验结果显示，阿托伐他汀、氨氯地平、高剂量冠心平均可明显降低AS小鼠ox-LDL、LoX-1、LoX-1 mRNA水平，且高剂量冠心平抑制LoX-1作用优于阿托伐他汀、氨氯地平；低剂量冠心平虽然对AS小鼠血清ox-LDL、LoX-1 mRNA水平降低作用不明显，但对LoX-1有明显的抑制作用，说明冠心平具有调脂和抗炎作用，且其剂量的大小对抑制炎症因子的表达存在一定的差异性和特异性。

AS发生早期，血管内皮受损后，细胞分泌单核细胞趋化因子、ICAM-1、ELAM-1等活性物质，促使白细胞在病变处聚集，单核细胞游走到内皮下变成巨噬细胞，吞噬脂质成为泡沫细胞，形成脂质斑块。内皮细胞和白细胞在受到炎性细胞因子、过氧化脂质等各种刺激因素作用后表达活性升高，ICAM-1基因开始转录，ICAM-1在细胞表面的表达迅速上调，其中在血管内皮表达最强，进而增强了白细胞与血管内皮细胞之间的黏附，促进炎症的发生和发展。ELAM-1可介导中性粒细胞黏附，炎性刺激时，活化的大血管及毛细血管均可表达ELAM-1，脂质过氧化可诱导体外培养的人内皮细胞(EC)表达血管细胞黏附分子(VCAM)-1及ELAM-1，使单核细胞在内皮细胞黏附及向EC下迁移显著增加〔8，9〕。本实验结果说明高剂量冠心平具有抑制黏附因子的作用。冠心平中的黄精、当归、三七、瓜蒌皮、甘松具有益气养阴、化痰通络、活血祛瘀、行气止痛之功效。本方源自古方当归补血汤(《兰室秘藏》)加减，方中黄精易黄芪既补中益气，又能滋阴，为君药；当归养血活血，补中有行；三七活血化瘀通脉，两味共为臣药；瓜蒌皮宽胸化痰、开痹散结，为佐药；甘松理气止痛，与三七同入心经，可治“卒心腹痛满”，同为使药。全方药物性味平和，攻补兼施，甚切冠心病气阴两虚、痰瘀互阻之病机。前期的临床研究表明，冠心平能调节血脂水平、保护血管内皮、改善心肌缺血。体外实验〔4〕证明，冠心平含药血清能减少细胞上清液中ox-LDL、ICAM-1、ELAM-1含量，减少血液中单核细胞与EC黏附，继而减少内皮下组织巨噬细胞及泡沫细胞的形成，从而抑制炎症的发生发展。现代药理研究发现，黄精，三七，甘松，当归，瓜蒌皮均具有抗炎症作用〔10～14〕。阿托伐他汀为他汀类血脂调节药，可通过抑制肝脏内HMG-COA还原酶及胆固醇的生物合成从而降低血胆固醇、LDL、三酰甘油水平、提高高密度脂蛋白水平。此外，该药还有延缓AS程度、抗炎、保护神经和抗血栓等作用〔15〕。氨氯地平可降低血脂〔16〕、下调血管紧张素Ⅱ诱导的小鼠主动脉内皮细胞血凝素样ox-LDL的表达，从而减少脂质的摄入〔17〕，并能抑制AS斑块处单核细胞趋化蛋白1的表达，下调外周血单核细胞上单核细胞趋化蛋白1受体的表达和Rho活性〔18〕，因此具有抗AS作用。用上述两药作为对照药物，使本研究结果更具可信性。

ox-LDL、ICAM-1、ELAM-1均是血管内皮损伤后细胞分泌的活性物质，但三者促进AS发生、发展的途径不同，ICAM-1通过增强白细胞与血管内皮细胞之间的黏附，ELAM-1通过增加单核细胞在内皮细胞上黏附及向EC下迁移，ox-LDL通过增加内皮细胞黏附蛋白的表达。这些炎症影响因子在炎症过程中相互影响、相互关联。

综上所述，冠心平可有效降低AS模型小鼠ox-LDL、ELAM-1、ICAM-1、LoX-1、LoX-1 mRNA水平，具有抗AS作用。