基于网络药理学预测白花蛇舌草治疗肝癌的分子机制

覃玉冰， 林炜基， 曾广必， 孙伟鹏， 张璐， 叶小卫

（1.广州中医药大学第一临床医学院，广东广州 510405；2.广州中医药大学第一附属医院，广东广州 510405）

肝癌是病死率最高的恶性肿瘤之一。我国肝癌死亡率极高，给社会和医疗带来沉重的负担[1]。大部分肝癌发现时已属中晚期，无法接受根治性手术治疗[2]。现代中医对肝癌治疗强调“整体调治”、“扶正祛邪”，可以弥补西医的许多不足[3]。

白花蛇舌草主要生长于我国江南及两广地区，味苦性寒，具有清热解毒、散结止痛、利尿除湿的功效，是临床治疗肝癌的常用中药。研究其单味药抗肝癌的分子作用机制对探讨肝癌病机及加减白花蛇舌草的中药方剂的配伍有较大的意义。现代研究表明，白花蛇舌草可通过多种途径起到抗肿瘤作用[4]，但目前尚未全面地阐明其作用机制。

网络药理学能运用多种技术揭示“药物—基因—靶点—疾病”之间复杂的网络关系[5]。因此，本研究应用网络药理学预测白花蛇舌草治疗肝癌多靶标、多通路协同作用，以期为临床及相关基础研究提供参考，现将研究结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 药物化学成分和活性成分的获取 在中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP）分别以“白花蛇舌草”为关键词检索，获得该药物含有的化学成分的信息。考虑到中药成分纷繁复杂，并非所有成分均能进入体内发挥作用，故选取同时满足口服利用度（OB）大于30%、类药性（DL）值大于0.18 2个条件的化学成分作为其活性成分。并通过Pubchem检索出每一个活性成分的3D结构，以mol2格式保存。

1.2 活性成分作用靶标的获取 将所有活性分子的3D结构上传到DRAR-CPI服务器，基于反向分子对接方法，对活性成分和蛋白相互作用的亲和性进行打分。按照服务器推荐，选定Z-score＜-0.5的蛋白作为白花蛇舌草活性分子的预测靶标。通过Uniport数据库检索白花蛇舌草活性分子的预测靶标的PDB ID，限定物种为“human”，从而获取预测靶标的相应基因。

1.3 肝癌相关靶标基因的获取 分别在GeneCards数据库和OMIM数据库中以“liver cancer”为关键词检索与肝癌相关的靶标基因。并与白花蛇舌草活性分子的预测靶标基因进行对比，筛选出共同靶标基因，作为白花蛇舌草活性成分抗肝癌的潜在作用靶标。

1.4 成分—作用靶标网络构建与分析 将白花蛇舌草的活性成分与抗肝癌作用靶标导入Cytoscape软件，构建其成分—作用靶标网络。

1.5 核心靶标相互作用网络构建与分析 基于String数据库为背景网络数据库，将白花蛇舌草抗肝癌的潜在靶标导入String数据库，限定物种为“human”，检索获得蛋白相互作用关系，以TSV格式保存结果。再将其导入Cytoscape软件绘制“蛋白相互作用关系”网络，然后使用Cytoscape的Network Analyzer工具进行网络分析，并根据连接度（degree）作为指标调节节点的大小、颜色，绘制蛋白相互作用网络图。

1.6 分子对接 分子对接技术（molecular docking）是利用计算机模式识别和优化技术，在三维结构数据库中搜索能与特定药物作用靶点在几何和化学上相匹配的分子，实现计算机辅助药物筛选（虚拟筛选）。因此，基于上述的蛋白相互作用网络，筛选出degree值最高的5个靶标，并导入System Dock Web Site服务器与白花蛇舌草活性分子进行对接，并通过对结果中的Docking Score进行分析，评估白花蛇舌草活性分子与核心靶标之间的结合潜力。

1.7 生物学过程与通路分析 DAVID数据库为大量的基因或蛋白提供系统全面的生物功能注释信息，并能找出最显著富集的生物学注释。将白花蛇舌草的作用靶标导入DAVID数据库，进行基因本体论（Gene Ontology，GO）分析和京都基因和基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGGK）通路富集分析，得到并保存结果。选取满足P＜0.001的通路，并根据富集基因数的大小，由大到少排序，选取排名前20的通路，使用OmicShare网站绘图。

1.8 成分—靶标—通路网络构建 通过对富集基因数大小排名前20的KEGG通路的分析，结合相关文献检索，筛选出可能与抗肝癌相关的通路，找出富集在这些通路上白花蛇舌草抗肝癌的靶点，并与相应药物的活性分子相配对，构建出“成分—靶标—通路”的网络关系图。

2 结果

2.1 白花蛇舌草活性成分分析 在TCMSP数据库中，以OB值大于30%、DL值大于0.18为筛选条件，收集白花蛇舌草的活性成分，其中符合条件的活性成分共有15个，如鸡屎藤次苷、多孔甾醇、京尼平苷、2-羟基-3-甲基蒽醌、车叶草苷等。另外，本研究还选择了部分OB值低于30%，但含量较高，具有较高药理研究价值的活性成分，如鸡屎藤次苷、多孔甾醇、京尼平苷等。

2.2 潜在靶标预测 在DRAR-CPI服务器中检索白花蛇舌草活性分子对应的潜在靶标，共获得829个，去除重复靶标后，共获得486个潜在靶标。通过与GeneCards、OMIM数据库中与肝癌相关基因的对比，筛选出抗肝癌的可能潜在靶基因73个，主要是肿瘤坏死因子α（TNF-α）、细胞外基质金属蛋白酶诱导因子147（CD147）、白细胞介素6（IL-6）、染色质解旋酶DNA结合蛋白1样基因（CHD1L）、信号传导与转录激活因子3（STAT3）等。

2.3 成分—靶标网络构建 分别将白花蛇舌草活性成分和潜在靶标的相关信息输入Cytoscape软件中，构建白花蛇舌草的成分—靶标网络。图1结果显示，图中含有节点88个，边线257条。其中，六边形节点代表白花蛇舌草活性成分，圆形节点代表潜在靶标。边线代表活性成分与潜在靶标的相互关联。由成分—靶标网络图可知，同一活性成分可以作用于不同靶标，同一靶标也可对应不同活性成分，体现出白花蛇舌草治疗肝癌具有多成分、多靶标的特点。

图1 白花蛇舌草“成分—靶标”网络Figure 1 “Component-target”network of Herba Hedyotis Diffusae

2.4 靶标相互作用网络构建 通过String数据库获取白花蛇舌草活性分子与肝癌相关靶标的相互关系，并将数据导入Cytoscape软件，构建靶标相互作用网络。图2结果显示，靶标相互作用网络中包含节点73个，边线311条。其中圆形节点代表蛋白靶标，边线代表蛋白靶标之间的相关性。节点的面积大小表示蛋白靶标的degree值大小，节点面积越大，颜色越深，表示其degree值越大。通过比较degree值的大小，并结合现有的研究结果，推测白花蛇舌草抗肝癌与CD147、CHD1L、IL-6、TNF-α、STAT3这5个靶基因有关。

图2 白花蛇舌草潜在靶标相互作用网络Figure 2 Interaction network of candidate targets of Herba Hedyotis Diffusae

图3 Docking Score值柱状图Figure 3 Histogram for Docking Score

2.5 分子对接 选取靶标相互作用网络中degree值最大的5个靶基因名称——CD147、CHD1L、IL-6、TNF-α、STAT3，将其输入 System Dock Web Site软件，并与白花蛇舌草15个活性分子进行分子对接。图3结果显示，共有9个（12%）的Docking Score值大于 7，36个（48%）的 Docking Score值在5.0～7.0之间，20个（27%）的 Docking Score值在4.25～5.0之间，10个（13%）的Docking Score值小于4.25。Docking Score值表示分子与靶标之间结合能力的强弱，一般认为Docking Score值大于4.25表示分子和靶标具有一定的结合能力，大于5.0表示结合能力较强，大于7.0表示结合能力很强。因此，根据结果提示，白花蛇舌草的活性成分和靶标之间具有良好的结合能力。

2.6 GO和KEGG通路富集分析 对白花蛇舌草活性分子的对应靶标进行GO和KEGG通路富集分析，以P＜0.05为筛选条件，筛选出富集基因数量较大的通路和生物过程。图4结果显示，细胞成分（CC）分析富集基因数量较大的有细胞核通路、细胞器膜通路、细胞外区通路等。图5结果显示，分子功能（MF）分析富集基因数量较大的有细胞膜通路、细胞核通路、细胞基质通路等。图6结果显示，生物进程（BP）分析富集基因数量较大的有正调控DNA转录通路、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路等。图7结果显示，由KEGG通路富集分析结果可知，神经降压素（NTS）信号通路、叉头状转录因子O亚家族蛋白（FoxO）信号通路、类胰岛素生长因子（IGF）、丝/苏氨酸蛋白激酶AKT信号通路、BCL信号通路、细胞外信号调节激酶（EPK）1信号通路等与白花蛇舌草治疗肝癌的潜在靶标的相关性明显。

图4 白花蛇舌草活性成分潜在靶标GO通路富集分析的CC分析Figure 4 GO pathway enrichment analysis of candidate targets of active components in Herba Hedyotis Diffusae based on cellular components（CC）analysis

图5 白花蛇舌草活性成分潜在靶标GO通路富集分析的MF分析Figure 5 GO pathway enrichment analysis of candidate targets of active components in Herba Hedyotis Diffusae based on molecular function（MF）analysis

2.7 “成分—靶标—通路”网络构建 综合考虑分析GO和KEGG通路富集分析的结果，筛选出可能具有抗肝癌作用的通路，并将其与白花蛇舌草的活性分子和相应的潜在靶标一一对应，即活性分子与靶标对应，靶标与可能通路对应，从而构建出白花蛇舌草治疗肝癌的“成分—靶标—通路”网络，见图8。其中黄色菱形代表白花蛇舌草的活性成分，红色圆形代表作用靶点，蓝色圆形代表涉及的通路。如图8显示，白花蛇舌草治疗肝癌涉及鸡屎藤次苷、多孔甾醇、京尼平苷、2-羟基-3-甲基蒽醌、车叶草苷等活性成分15个，这些活性成分作用的靶标有CD147、CHD1L、IL-6、TNF-α、STAT3等5个，这些靶标主要被包含在NTS、FoxO、IGF、AKT、BCL、EPK1信号通路中。

3 讨论

本研究收集到白花蛇舌草中具有抗肝癌的化学成分主要有鸡屎藤次苷、多孔甾醇、京尼平苷、2-羟基-3-甲基蒽醌、车叶草苷等。研究表明，鸡屎藤次苷、京尼平苷、车叶草苷等可以通过激活TLR-4通路增强巨噬细胞的吞噬功能，从而达到抗炎的功效[6]。现有化学实验研究也印证2-羟基-3-甲基蒽醌及苷类有抗肿瘤的活性及作用[7]。

图6 白花蛇舌草活性成分潜在靶标GO通路富集分析的BP分析Figure 6 GO pathway enrichment analysis of candidate targets of active components in Herba Hedyotis Diffusae based on biological process（BP）analysis

图7 白花蛇舌草活性成分潜在靶标的KEGG通路富集分析Figure 7 KEGG pathway enrichment analysis of candidate targets of active components in Herba Hedyotis Diffusae

图8 “成分—靶标—通路”网络关系图Figure 8“Component-target-pathways”network

本研究发现，白花蛇舌草可通过CD147、IL-6、TNF-α、STAT3等靶标作用达到抗肝癌的作用。一系列的研究显示，CD147在肝癌患者体内高表达，可诱导合成大量MMP和血管生成从而促进肝癌细胞的侵袭和转移[8]。冯越等[9]的实验研究结果显示在肝癌患者中TNF-α水平明显高于正常值，可与化疗药物协同作用抑制肿瘤的生长与转移。此外，研究显示STAT3有一定程度的促癌作用，如果特异性敲除小鼠的STAT3基因，肝癌的发展过程与野生型小鼠有明显差异。乙型肝炎病毒的X蛋白可以调控IL-6的表达，当IL-6浓度超过一定的阈值后就可以促进肿瘤的发生和发展[10]。根据本研究结果，推测白花蛇舌草可能通过提高体内TNF-α水平或下调CD147、STAT3、IL-6的表达来发挥抗肝癌的作用。李秀萍等[11]对肝损伤的小鼠进行实验后发现，白花蛇舌草可调整CD4+T细胞和CD8+T细胞之间的平衡，降低血浆TNF-α和IL-6的水平，减少肝损伤。南锡浩等[12]研究证实白花蛇舌草可通过作用于JAK2/STAT3通路途径而对T24造成影响。以上报道均与本研究结果相符合。

本研究结果显示，与白花蛇舌草治疗肝癌相关的通路有：NTS、FoxO、IGF、AKT、BCL、EPK1等。其中，NTS可以促进炎症因子释放，形成的炎性微环境具有促进肿瘤生长的作用[13]。肝癌细胞中FoxO 3a的表达下调会加速肝癌干细胞的更新过程，而类胰岛素生长因子（IGF）对FoxO 3a的表达起反向调节的作用[14]。在BCL家族中，BCL-2具有抑制凋亡的作用，BAD可与BCL-2结合达到促进凋亡的效果。AKT可以促进BAD磷酸化，阻止其与BCL-2结合达到抑制凋亡的作用。研究显示，在肝细胞性肝癌组中，BCL-2阳性表达率显著高于胆管癌和肝硬化组[15，16]。

本研究通过网络药理学的研究方法，分析白花蛇舌草在抗肝癌治疗方面的有效化学成分和分子机制，结果显示白花蛇舌草中具有治疗肝癌作用的化学成分可能是鸡屎藤次苷、多孔甾醇、京尼平苷、京尼平、车叶草苷等。此药可能通过CD147、IL-6、TNF-α、STAT3、CHD1L等靶标及NTS、FoxO、IGF、AKT、BCL、EPK1等信号通路起治疗作用。通过相关网络图的构建可直观地显示出白花蛇舌草治疗肝癌具有多成分、多途径等共同作用的特点，符合中医药治疗疾病的特点，相比西药的单基因—单靶点的作用机制，优势明显。本研究通过分子对接验证了网络药理学数据的可靠性，所得结果也与现有文献报道高度符合，但本研究结果只是一种分子机制上的预测探讨，药物具体作用机制的确认仍需通过进一步验证。