毛诃子提取物对高原肺动脉高压大鼠心脏的保护作用

杨 涛， 史 超， 艾尼娃尔·艾克木， 张向阳， 迪丽努尔·买买提依明

(1新疆医科大学中心实验室， 乌鲁木齐 830011； 2新疆医科大学第一附属医院综合心脏内科， 乌鲁木齐 830054；3新疆医科大学临床研究院， 乌鲁木齐 830011)

高原肺动脉高压(high altitude pulmonary hypertension，HAPH)是指机体从平原环境进入高海拔地区后，在缺氧环境中诱导发生的肺血管病变，进而导致肺循环阻力升高[1-3]。在HAPH形成的初期，由于供氧不足引发肺微小血管发生收缩，随着缺氧时间的延长，肺动脉出现平滑肌细胞肥大、管壁变厚、内径变窄等改变，导致肺动脉压(PAP)逐步上升，持续升高的PAP使心脏压力负荷逐步上升，使得右心室增大、心室壁肥厚，随着时间的推移，机体供氧不足造成心脏组织损伤，降低心输出量，最终引发心衰[4-5]。目前在临床中通常采用舒张血管或松弛平滑肌药物(如：硝苯地平、氨茶碱等)缓解PAP症状。毛诃子为使君子科植物毗黎勒孔[Terminaliabillerica(Gaertn.)Roxb.]的干燥成熟果实[6]，主要化学成分为三萜皂苷、强心苷、木脂素、鞣质类、脂肪酸等[7]，具有抗氧化、降脂、抑菌等多种药理作用[8-9]，研究表明由毛诃子组成的三果汤散对高原性疾病具有良好的治疗作用[10-11]。本研究采用HAPH大鼠模型，探究毛诃子提取物对HAPH所致大鼠心脏损伤的保护作用，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器DW-86L338型超低温冰箱(中国海尔公司)， Multiskan 352型酶标仪(美国赛默飞世尔科技公司)，Labsystems AC8型洗板机(美国赛默飞世尔科技公司)，TG16W型微量高速离心机(长沙维尔康湘鹰离心机公司)，BL-420电生理记录仪(中国成都泰盟公司)，ks606731型小动物呼吸机(北京科思佳公司)，西北特殊环境人工实验舱(新疆军区总医院)。

1.2 试药硝苯地平片(山西云鹏制药有限公司，批号 F160601)，毛诃子(新疆麦迪森维药有限公司，批号 P30001307)，大鼠EPO ELISA 试剂盒 (中国台湾亚诺法生技公司，批号 AD20180708)，大鼠C Reactive 蛋白ELISA试剂盒(上海艾博抗公司，批号 GR3184775-11)，大鼠IGF-1 ELISA 试剂盒(美国安迪公司，批号 P166960)，大鼠T-SOD ELISA 试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号 20180920)，大鼠MDA ELISA 试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号 20180919)，大鼠GSH-Px ELISA试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号 20180911)。

1.3 实验动物清洁级SD大鼠50只，雌雄各半，体质量(170±10)g，购于新疆医科大学动物中心，许可证号：SCXK(新)2016-0003。

1.4 HAPH模型建立随机选取40只SD大鼠，放置于西北特殊环境人工实验舱(气压：53.9 KPa)中30 d，建立HAPH模型；剩余10只SD大鼠，放置于新疆医科大学动物中心平原环境中(气压：92.9 KPa)，所有大鼠自由饮水进食喂养30 d。

1.5 药物的提取方法称取毛诃子药材1 kg，粉碎后过四号筛，用95%乙醇按照液料比1∶15 (g∶mL)、温度60℃、时间1.5 h进行提取，提取液经浓缩、干燥，即得毛诃子醇提物。另称取毛诃子药材1 kg，粉碎后过四号筛，用蒸馏水按照液料比1∶15(g∶mL)、温度60℃、时间1.5 h进行提取，提取液经浓缩、干燥，即得毛诃子水提物。

1.6 分组及给药方法将40只HAPH模型SD大鼠随机分为：高原肺动脉高压组(生理盐水0.4 mL/100 g体质量)、阳性组(硝苯地平片2.7 mg/kg体质量)、毛诃子醇提物组(毛诃子醇提物270 mg/kg体质量)和毛诃子水提物组(毛诃子醇提物270 mg/kg体质量)，平原环境中的10只大鼠为平原组(生理盐水0.4 mL/100 g体质量)，各组大鼠自由进食饮水，连续灌胃15 d。

1.7 大鼠肺动脉血压的测定[12]给药完成24 h后，采用戊巴比妥钠将各组大鼠麻醉后，以平卧状态固定于手术台，打开胸腔，充分暴露肺和心脏，分离颈静脉，插管经右心房、右心室进入肺动脉，测定肺动脉血压，记录血压结果。

1.8 大鼠血清中CRP、IGF-1和EPO含量的测定各组大鼠腹主动脉取血，按试剂盒说明方法操作，测定大鼠血清中C-反应蛋白(CRP)、促生长因子(IGF-1)和促红细胞生成素(EPO)的含量。

1.9 大鼠心脏组织中MDA、SOD和GSH-PX含量的测定摘取各组大鼠心脏，按照试剂盒说明方法对心脏组织进行处理，测定心脏组织中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的含量。

1.10 大鼠心脏组织病理学检查取“1.9”项下大鼠心脏组织，置于固定液中固定，使用梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，苏木精-伊红染色(HE)，置于显微观察各组大鼠心脏组织的形态变化。

2 结果

2.1 各组大鼠肺动脉血压测定结果与平原组比较，高原肺动脉高压组、阳性组、毛诃子醇提物组、毛诃子水提物组大鼠肺动脉血压升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与高原肺动脉高压组比较，阳性组、毛诃子醇提物组大鼠肺动脉血压下降，差异有统计学意义(P<0.05)。与阳性组比较，毛诃子水提物组、毛诃子醇提物组大鼠肺动脉血压升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠肺动脉压测定结果

注：与平原组比较，*P<0.05； 与高原肺动脉高压组比较，#P<0.05；与阳性组比较，★P<0.05。

2.2 各组大鼠血清CRP、IGF-1、EPO含量的测定结果与平原组比较,高原肺动脉高压组、阳性组、毛诃子醇提、水提物组大鼠血清中CRP含量升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与高原肺动脉高压组比较,阳性组、毛诃子醇提物组、毛诃子水提物组大鼠血清中CRP含量降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与阳性组比较, 毛诃子醇提物组、毛诃子水提物组大鼠血清中CRP含量降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与平原组比较,高原肺动脉高压组、毛诃子醇提物组、毛诃子水提物组大鼠血清中IGF-1含量升高，差异有统计学意义(P<0.05)；阳性组大鼠血清中IGF-1含量降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与高原肺动脉高压组比较,阳性组大鼠血清中IGF-1含量降低，差异有统计学意义(P<0.05)；毛诃子醇提物组、毛诃子水提物组大鼠血清中IGF-1含量升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与阳性组比较，毛诃子醇提物组、毛诃子水提物组大鼠血清中IGF-1含量升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与平原组比较,高原肺动脉高压组、阳性组、毛诃子醇提物组、毛诃子水提物组大鼠血清中EPO含量升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与高原肺动脉高压组比较,阳性组、毛诃子醇提物组、毛诃子水提物组大鼠血清中EPO含量降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与阳性组比较,毛诃子醇提物组大鼠血清中EPO水平降低，差异有统计学意义(P<0.05),见表2。

表2 各组大鼠血清中CRP、IGF-1、EPO含量的测定结果

注：与平原组比较，*P<0.05； 与高原肺动脉高压组比较，#P<0.05；与阳性组比较，★P<0.05。

2.3 各组大鼠心脏病理学检查结果平原组大鼠在低、高倍视野下可见心肌结构均正常，心肌细胞染色清楚，细胞核致密，心肌纤维排列整齐，横纹清楚，未见颗粒样变、嗜酸性病变细胞浸润等异常病变情况(图1A，图1B)。高原肺动脉高压组大鼠在低倍视野下可见心肌纤维排列混乱、横纹不清(图1C)，在高倍视野下可见心肌纤维呈颗粒样病变并少量嗜酸性病变，心肌间质血管明显扩张充血，偶见炎性细胞浸润(图1D)。阳性组大鼠在低倍视野下可见心肌纤维排列不规则，横纹不清(图1E)，在高倍视野下可见少量大鼠心肌纤维轻度颗粒样变，偶见心肌间质血管轻度扩张充血(图1F)。毛诃子醇提物组大鼠在低倍视野下可见心肌间质血管明显扩张充血(图1G)，在高倍视野下可见心肌纤维轻度肿胀，心肌细胞嗜酸性病变，少量炎细胞浸润(图1H)。毛诃子水提物组大鼠在低倍视野下可见心肌纤维排列不规则，横纹不清(图1I)，在高倍视野下可见大鼠心肌纤维颗粒样变形并少量嗜酸性病变细胞浸润，部分心肌间质血管扩张充血并偶见炎性浸润(图1J)。

2.4 各组大鼠心脏SOD、MDA、GSH-Px的测定结果与平原组比较，高原肺动脉高压组、阳性组、毛诃子醇提物组、毛诃子水提物组大鼠心脏中SOD、GSH-Px活性降低，MDA含量升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与高原肺动脉高压组比较，阳性组、毛诃子醇提物组、毛诃子水提取组大鼠心脏组织中SOD、GSH-Px活性增强，MDA含量降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与阳性组比较，毛诃子醇提物、毛诃子水提物组心脏中SOD、GSH-Px活性增强，MDA含量降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

A 平原组(HE×100)

B 平原组(HE×400)

C高原肺动脉高压组(HE×100)

D高原肺动脉高压组(HE×400)

E 阳性组(HE×100)

F阳性组(HE×400)

G毛诃子醇提物组(HE×100)

H毛诃子醇提物组(HE×400)

I 毛诃子水提物组(HE×100)

J 毛诃子水提物组(HE×400)

图1 各组大鼠心脏病理学检查显微图

3 讨论

海拔在2 500 m以上的地区称为高原地区[13]。全球大约有超过1亿人生活在高原地区，主要分布在我国的青藏高原、帕米尔高原以及南美洲的玻利维亚高原等。初次进入高原者，由于机体持续处于缺氧状态从而刺激外周化学感受器(颈动脉窦)，进而刺激呼吸中枢引起早期通气量增加，机体可吸入更多氧气已进行代偿，此过程称为高原习服，即人体对高原低氧的适应过程。当初登高原者，发生高原习服失败时，则会引起高原红细胞增多症、高原肺动脉高压症[14-15]。本研究通过西北特殊环境人工实验舱模拟海拔5 000 m高原环境，建立高原肺动脉高压模型大鼠。实验结果显示，与平原环境大鼠相比，高原环境大鼠肺动脉血压增高，给予硝苯地平干预后，肺动脉压降低，表明高原肺动脉高压大鼠模型建立成功。

表3 各组大鼠心脏SOD、MDA、GSH-Px的测定结果

注：与平原组比较，*P<0.05； 与高原肺动脉高压组比较，#P<0.05； 与阳性组比较，★P<0.05。

活性氧(ROS)为一类广泛存在生物体中富含有氧元素的物质，并且具有活泼的性质，如：激发态的氧分子、过氧化物、含氧自由基[16]。在正常机体内，ROS的产生和消耗维持在平衡状态，当机体受到某些内因或者外部因素刺激后，机体发生代谢紊乱，使ROS产生过多或利用减少，过剩的ROS可造成细胞膜氧化损伤，最终导致多种组织出现氧化应激损伤。有证据表明，高原环境下带来的低氧诱导了ROS的过载[17]，过载的ROS最终导致HPH的发生[18]。当机体暴露于高海拔环境中时，血液中含氧量下降，机体处于氧化应激状态，氧化损伤产物蛋氨酸亚砜、MDA等的含量增加， SOD、GSH-Px等内源性抗氧化酶活性降低。本研究结果显示，高原肺动脉高压组大鼠心肌内SOD、GSH-Px活性减弱，MDA的含量增加，这表明HAPH大鼠处在氧化应激状态，并且出现心脏的损伤。给予毛诃子(醇、水)提取物进行干预，HAPH大鼠心组织内SOD、GSH-Px活性增强， MDA的含量降低，这表明不同溶媒毛诃子的提取物，均可改善HAPH大鼠的氧化应激状态，减轻心脏的氧化损伤程度。

机体长期处于高海拔区域，慢性低氧会直接刺激机体系统性炎症的发生。CRP[19]是重要的炎症介质，其水平不仅可作为组织受损程度的判断依据，还可以作为心血管疾病的危险因子。同时，CRP可通过直接损伤血管内皮细胞、促进ET-1 的分泌，降低NOS的水平，诱导内皮细胞功能紊乱使肺血管痉挛从而参与HAPH的形成。促红细胞生成素(EPO)为机体中内源性糖蛋白激素[20]，可促使红细胞产生。当机体长期处于高原环境时，低氧能够刺激机体产生大量EPO，与靶器官结合后，可通过激活JAK2及STAT-5相关信号传导途径，进而诱导红细胞大量增殖，导致血液黏稠度增加、微循环障碍、血栓的形成、广泛的脏器损伤。IGF-1亦被称作促生长因子，是一类蛋白多肽，是一种具有心血管保护作用的细胞因子[21]。研究发现，IGF-1可通过多种途径，舒张血管、消除多余氧自由基等。本实验结果显示：HAPH大鼠血清中CRP 、EPO含量升高，IGF-1含量降低，给予毛诃子水提取物、醇提取物干预后，大鼠血清中以上指标都趋向正常水平,表明毛诃子水提取物、醇提取物对HAPH大鼠的心脏损伤具有保护作用。