南宁市肉牛的Y染色体遗传多样性分析

宣泽义,曹艳红,吴柱月,黄明光,陈少梅,王凯悦，陈 宏， 雷初朝*

(1.广西壮族自治区畜牧研究所，广西 南宁 530001; 2.西北农林科技大学动物科技学院，陕西 杨凌 712100)

动物Y染色体单倍型保持完整，不容易受重组和回复突变的影响，突变率较低，是进化事件的忠实记录者[1]。Y染色体单倍型分析可以揭示牛父系起源进化的信息，Götherström等[2]利用Y染色体单核苷酸多态性(Y-SNPs)定义了家牛3个Y染色体单倍型组(普通牛Y1和Y2以及瘤牛Y3单倍型组)。Bonfiglio等[3]在牛USP9Y基因的第26内含子处鉴定了1个新的分子标记，81 bp的插入能将Y1单倍型组与Y2和Y3单倍型组区分开，而4个Y3特异性序列变异能把Y3单倍型组和Y2单倍型组区分开。

我国黄牛品种资源十分丰富，根据2011年修订的《中国畜禽遗传资源志：牛志》记载，目前有53个地方黄牛品种、8个培育品种和11个国外引入品种[4]。本研究采集的公牛样本采自广西壮族自治区首府南宁市的一个大型肉牛屠宰场，按照区域地理分布将其统称为“南宁牛”。为了探究广西南宁市肉牛屠宰场屠宰的黄牛Y染色体单倍型组组成和父系起源，本研究对所采集的南宁肉牛样本进行Y染色体USP9Y基因多态性分析，以调查南宁屠宰市场上黄牛的父系遗传背景，为了解南宁市场上肉牛的来源与遗传组成奠定基础。

1 材料与方法

1.1 样本采集与基因组DNA提取

在广西南宁市一屠宰场中采集73头公牛的耳组织样带回实验室，采用苯酚—氯仿法提取全基因组DNA，放在-20 ℃保存备用。

1.2 引物合成与PCR扩增

参照Bonfiglio等[3]发表的牛Y染色体USP9Y基因序列合成引物，上游引物为：F-5′-AAACCCTTCAAGGTAATAAAACAAAA-3′，下游引物为R：5′-CACAGCTCCTCAAAACCAGA-3′。PCR反应体系为12.5 μL：ddH2O 5.00 μL，2×Taq MasterMix 6.00 μL，上下游引物各0.25 μL(10 pmol/μL)，模板DNA 1.00 μL。扩增条件为：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，36个循环，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.3 PCR扩增产物检测与酶切分析

用2%的琼脂糖凝胶对黄牛USP9Y基因的PCR产物进行电泳检测，根据扩增条带大小进行初步的Y染色体单倍型组判型，再用SspI限制性内切酶对PCR产物进行酶切。SspI酶切体系为8.0 μL：SspI酶(10.0 U/μL)0.4 μL(TaKaRa公司)，10×SspI Buffer 0.8 μL，PCR产物2.4 μL，ddH2O 4.4 μL。置于37 ℃的摇床1 h后，用2%的琼脂糖凝胶对酶切产物进行电泳检测，根据PCR产物被酶切的情况进行单倍型组分析和统计。

1.4 数据统计分析

用Arlequin V3.11软件计算单倍型频率和单倍型多样度(H±SD)。

2 结果与分析

2.1 南宁牛USP9Y基因PCR产物多态性与SspI酶切鉴定

通过对黄牛USP9Y基因的PCR扩增和电泳检测，结果表明，73头公牛USP9Y基因的PCR产物显示471 bp和552 bp两种带型(图1)。南宁牛有71个个体的PCR扩增产物为552 bp，仅有2个个体为471 bp，依据Bonfiglio等[3]的判定标准，这2个带型为471 bp的南宁牛属于普通牛Y1单倍型组，而剩余的71头南宁牛是Y2还是Y3单倍型组需要通过SspI限制性内切酶酶切的方法来进一步区分。利用SspI酶对这71头牛的PCR产物进行酶切，发现有28头牛的PCR产物能被SspI酶切开成2条带(215 bp和338 bp)，而有43头牛的PCR产物不能被SspI酶切开，只有1条带552 bp，说明这71头南宁牛中有28头牛属于Y3单倍型组，43头牛属于Y2单倍型组。

注：M泳道为DL2000 marker，自上而下依次为2 000，1 000，750，500，250，100 bp。 〗图1 南宁牛USP9Y基因的PCR产物扩增与酶切多态性

2.2 南宁牛Y染色体单倍型频率和单倍型多样度

对73头南宁牛中Y1、Y2和Y3单倍型组个体进行频率统计，结果显示：Y1、Y2和Y3单倍型组分别有2，48，23个个体，所占频率分别为2.74%，58.90%和38.36%。单倍型多样度为0.5122±0.0309。

3 讨 论

家牛Y-SNPs标记已被广泛用于世界牛品种/群体的遗传多样性、群体遗传结构、起源和迁徙路线等研究[5-6]。在对国外家牛品种的研究中，Son等[7]对东北亚地区蒙古、日本和韩国3个国家的牛品种分析表明，这些品种只拥有普通牛Y染色体单倍型组，而未检测到瘤牛单倍型组。Götherström等[2]和Ginja等[8]对多个欧洲家牛品种进行分析，结果表明欧洲牛为普通牛起源，其中北欧品种主要是Y1单倍型组，南欧品种主要是Y2单倍型组。Edwards等[9]通过分析138个欧洲和亚洲牛品种表明，亚洲西南部主要为瘤牛Y3单倍型组，Y1和Y2单倍型组主要分布在英国、北欧和俄罗斯地区。

在中国部分地方黄牛品种的父系遗传分析中，Li[10-11]等指出中国北方的家牛主要是Y2单倍型组，南方主要是Y3单倍型组，中原是Y2和Y3单倍型组的混合区。利用家牛2个经典的Y-SNPs标记(ZFY10和UTY19)，赵晓诚等[12]分析了岭南牛的Y染色体多态性，指出岭南牛的父系起源以瘤牛为主，普通牛为辅；夏小婷等[13]结合Y-SNPs与Y-STRs的分型结果，发现关岭牛主要以Y3单倍型组为主；李芳玉等[14]利用49头大别山牛的2个Y-SNPs标记及2个Y-STRs标记(INRA189和BM861)进行多态性检测，发现大别山牛只有瘤牛Y3父系起源。李秀良等[15]对28头涠洲牛进行分析，结果显示28头涠洲牛有Y3-88-156和Y3-90-156两种单倍型，单倍型频率分别为89.29%和10.71%，说明涠洲牛只有1个瘤牛Y3父系起源。从以上研究可以看出，中国南方黄牛主要是Y3单倍型组。

在本研究中，通过对73头南宁市一屠宰场的黄牛Y染色体上USP9Y基因的多态性分析，发现南宁牛有普通牛(Y1和Y2单倍型组)和瘤牛(Y3单倍型组)2个不同的父系起源，以Y2单倍型组为主，还包括少量的Y1单倍型组。根据地域分析，南宁牛属于南方黄牛类型，这与常振华等[1]、Li等[10]和李秀良等[15]指出的中国南方黄牛品种的起源进化不一致，表明南宁市屠宰场屠宰的肉牛来源比较复杂。传统上中国黄牛主要是役用，但近几十年来，人们对黄牛肉用价值的需求大大提高，为了提高我国黄牛的市场竞争力，从国外引入一些肉牛品种，如：以Y2单倍型组为主的皮埃蒙特牛、夏洛莱牛、利木赞牛、西门塔尔牛等；以Y1单倍型组为主的安格斯牛、荷斯坦牛等来提高我国黄牛的生长发育性能，导致全国各地的地方品种都因此而混杂，纯种数量急剧减少。因此，南宁市屠宰场屠宰的肉牛呈现较高的Y2单倍型组频率以及低频率的Y1单倍型组频率，一方面，说明广西地方黄牛品种也大量与国外引进的肉牛品种杂交；另一方面，说明广西南宁市肉牛屠宰场从周边省市大量购买杂交肉牛和少量育肥的奶公犊。从广西南宁市肉牛屠宰场的Y染色体父系起源来看，如火如荼的利用国外商品肉牛品种与全国各地地方黄牛品种的杂交模式，已经遍地开花，连比较偏远、经济相对落后的西南部，如广西地区也不例外。因此，从保护中国丰富的地方黄牛品种资源来看，全国各地加大地方黄牛品质资源的保护已经刻不容缓，如果再不加大保护力度，再过20年左右，中国宝贵的、引以为傲的丰富地方黄牛品种就会消失殆尽。