离子色谱法同时测定植物生长调节剂中氯化胆碱、甲哌鎓及N-甲基哌啶

朱作艺 ，张玉 ，王君虹 ，李雪 ，王伟 ，2，3*，孙彬

（1.浙江省农业科学院 农产品质量标准研究所，浙江杭州310021；2.农产品质量安全国家重点实验室省部共建培育基地，浙江杭州310021；3.农业部创意农业重点实验室，浙江杭州310021；4.武义中正食品检测有限公司，浙江金华321200）

0 引 言

近年来,植物生长调节剂广泛用于棉花、小麦、水果、蔬菜等农作物,在增强作物抗逆性、提高作物产量、改善产品品质、提高种植效益等方面发挥了巨大作用[1-2]。氯化胆碱和甲哌鎓作为常见的植物生长调节剂,可单独或作为混合剂应用于作物[3]。氯化胆碱和甲哌鎓均为季铵类化合物(见图1),在水和酸性溶液中具有良好的稳定性和溶解性[4],广泛用于改善作物品质和提高作物产量。

图1 3种目标分析物结构式Fig.1 Structure of three target analytes

标明农药剂型中活性成分的质量浓度对于消费者购买和使用该产品具有重要意义[5]。除此之外,监测农药剂型中杂质的含量同样重要。N-甲基哌啶是合成甲哌鎓的重要中间体,与甲哌鎓具有相似的结构(见图1)。N-甲基哌啶普遍存在于甲哌鎓原料以及商品化甲哌鎓剂型中。鉴于此,建立一种能同时测定植物生长调节剂混合剂型中的主要活性成分氯化胆碱、甲哌鎓及杂质N-甲基哌啶的快速简便方法,具有重要的意义。

分析水溶液中的季铵型农药相对较困难[6-7]。氯化胆碱是胆碱的盐酸盐形式,目前,对氯化胆碱的主要分析方法有LC-MS/MS[8-9]、生物传感器法[10]以及非抑制离子色谱法[11-12]。对甲哌鎓的主要分析方 法 有 HPLC[13]、 LC-MS[14-15]、 HILIC-MS/MS[16]、LC-MS/MS[17-19]、毛细管电泳[20]及拉曼光谱法[21]。以上用于季铵型农药化合物的定量检测方法大多涉及较昂贵或不常见的仪器,普通实验室难于实现。目前尚未见关于同时测定氯化胆碱、甲哌鎓及杂质N-甲基哌啶的文献报道,也未见关于N-甲基哌啶的测定方法的相关报道。

自1975年离子色谱问世以来,已在灵敏度、选择性、分析对象等方面取得了重大进展,尤其是抑制电导系统的发展[22]。 FEGERT等[23]于1991年建立了一种测定动植物基质中甲哌鎓的离子对方法,该方法采用柱切换技术,较为烦琐费时。本文建立了一种阳离子色谱交换分离-抑制电导同时直接检测氯化胆碱、甲哌鎓及N-甲基哌啶质量浓度的方法,该方法无须复杂的样品前处理过程,可在10 min内完成对以上3种目标化合物的检测,且常规阳离子不会干扰测定结果。该方法可应用于相关农药剂型的检测和质量控制。

1 实 验

1.1 仪器与试剂

Thermo Scientific ICS-3000离子色谱仪(Sunnyvale,CA,USA),配双重活塞系列泵,DS6电导检测器,柱温箱,Rheodyne六通阀,Chromeleon 6.80色谱工作站,Thermo Scientific IonPac CG17(50 mm×4 mm)保护柱+Thermo Scientific IonPac CS17(250 mm×4 mm)分离柱,Thermo Scientific CSRS300-4 mm电化学自再生抑制器；0.22 μm尼龙滤膜过滤头。

分析标准品(氯化胆碱,纯度99%;甲哌鎓,纯度99%;N-甲基哌啶,纯度97%)以及甲烷磺酸(methane sulfonic acid,MSA,纯度99.5%)均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司,甲哌鎓单独及混合可溶性水剂：市购,其他化学试剂均为分析纯,实验室所用均为18.2 MΩ·cm去离子水。

1.2 标准溶液配制及样品制备

用去离子水分别配制氯化胆碱、甲哌鎓及N-甲基哌啶的标准储备溶液(质量浓度为2 000 mg·L-1),于4℃冰箱中保存,用去离子水将标准储备溶液稀释成不同浓度的混合标准工作溶液。

样品直接用去离子水稀释,经0.22 μm尼龙滤膜过滤后,供离子色谱测定。

1.3 色谱条件

色谱柱为Thermo Scientific IonPac CG17(50 mm×4 mm)保护柱+Thermo Scientific IonPac CS17(250 mm×4 mm)分离柱;柱温为30℃;采用10 mmol·L-1MSA溶液等度淋洗;流速为1.0 mL·min-1;自再生电化学抑制模式,抑制电流为35 mA;电导池温度为 35 ℃;进样体积为 25 μL;外标法峰面积定量。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的选择

从图1中可以看出,氯化胆碱和甲哌鎓为季铵类化合物,N-甲基哌啶为叔胺类化合物,与甲哌鎓有相似的结构。因此,这3种化合物在酸性条件下可解离成阳离子,采用阳离子交换色谱对其进行分离。为研究此3种化合物的保留行为,进行了一系列固定相和流动相的选择和优化实验。首先,选用3种不同类型的阳离子交换色谱柱(Thermo Scientific IonPac SCS,IonPac CS12A和IonPac CS17)对上述3种化合物进行分离,实验结果表明,具有中等交换容量(1.45 meq/column)的IonPac CS17色谱柱在保留时间、分离度以及检测灵敏度上均优于其余2种。因此,本实验选用对水合质子具有高选择性的IonPac CS17色谱柱分离氯化胆碱、甲哌鎓及N-甲基哌啶。由于MSA具有较低的背景电导[24],因此选用MSA溶液作为淋洗液。对MSA淋洗液的条件进行了优化(见图2),当采用15 mmol·L-1MSA溶液淋洗时,3种化合物在6.0 min内全部出峰,但甲哌鎓和N-甲基哌啶重叠在一起(见图2中的4号峰),不能完全分开;当采用12 mmol·L-1MSA溶液淋洗时,3种化合物在8.0 min内全部出峰,但Ca2+与N-甲基哌啶无法实现完全分离,实样Ca2+在测定N-甲基哌啶时存在干扰;当采用10 mmol·L-1MSA溶液淋洗时,3种化合物在10.0 min内完全分离,峰形对称;为验证在该淋洗液浓度条件下常规阳离子是否对目标分析物存在干扰,特配制了同时含Li+,Na+,NH4+,K+,Mg2+和Ca2+的混合标准溶液,并于上述淋洗液浓度条件下进行测定,从图3中可以看出,6种常规阳离子对以上3种化合物的测定均不存在干扰。因此,本实验采用10 mmol·L-1MSA作为最佳淋洗液条件。

图2 不同浓度淋洗液条件下的分离效果色谱图Fig.2 Chromatograms of standard mixture solution obtained by eluent of different concentrations

图3 最佳色谱条件下混合标准溶液色谱图Fig.3 Chromatogram of standard mixture solution under the optimized conditions

2.2 线性关系、重现性及方法的检出限

用上述优化后的色谱条件,分别对氯化胆碱、甲哌鎓及N-甲基哌啶的混合标准工作溶液进行测定,以相应的色谱峰面积(y)对其质量浓度(x,mg·L-1)进行线性回归。氯化胆碱质量浓度在0.1～500 mg·L-1内线性关系良好,甲哌鎓质量浓度在0.5～500 mg·L-1内线性关系良好,N-甲基哌啶质量浓度在0.4～200 mg·L-1内线性关系良好,线性相关系数r均大于0.999 4。将质量浓度为20 mg·L-1的混合标准工作溶液,按优化后的色谱条件进样,连续进样6次,其保留时间相对标准偏差(RSD)为0.04%～0.05%,色谱峰高RSD为0.25%～0.47%,色谱峰面积RSD为0.30%～0.43%,表明该方法具有较好的重现性。信噪比(S/N)为3时,3种化合物的检出限(LOD)为28.0～112.5 μg·L-1;信 噪 比(S/N)为 10 时,3 种 化 合 物定量限(LOQ)为 93.5～375.0 μg·L-1(见表 1)。

2.3 样品测定及加标回收试验

根据上述样品前处理方法和优化后的色谱条件,分别对3个市购的植物生长调节剂样品进行测定,图4为氯化胆碱和甲哌鎓混合剂型样品色谱图,图5为其中1个只含甲哌鎓的水剂样品色谱图。从图4和图5中可以看出,商品化的甲哌鎓植物生长调节剂中均含有杂质N-甲基哌啶。通过外标法定量测定的3个市购样品,其主要成分(氯化胆碱和甲哌鎓)的质量浓度与商品标注的质量浓度不存在显著差异(p＞0.05),杂质N-

图4 氯化胆碱和甲哌鎓混合剂型样品色谱图Fig.4 Chromatogram of a mixed choline chloride and mepiquat chloride formulation

表1 方法的线性关系、检出限及精密度Table 1 Linear relationship，limit of detection and precision of the method

表2 实际样品分析结果Table 2 Analytical results of real samples

图5 甲哌鎓水剂样品色谱图Fig.5 Chromatogram of an individual mepiquat chloride formulation

3 结 论

建立了一种简单快速的离子色谱-抑制电导同时测定2种植物生长调节剂活性成分以及杂质的方法。样品用去离子水稀释后直接进样分析,采用Thermo Scientific CS17阳离子交换色谱柱以及10 mmol·L-1MSA溶液等度淋洗,可在10 min内完成3种目标分析物的测定。通过线性、选择性、灵敏度、重现性以及准确性等一系列方法学验证,结果表明,该方法操作简单、高效快速、线性范围宽、线性关系良好,具有较好的重现性和准确度,适用于一系列相关植物生长调节剂原料或商品化剂型主成分及杂质的测定,为植物生长调节剂原料或成品的质量控制提供了一种新型、简便、高效的分析方法。

表3 实际样品加标回收率结果Table 3 Recovery results of real sample