基于体外实验技术评价芫花素肝毒性风险△

汪祺，王亚丹，杨建波，刘越，文海若，马双成

中国食品药品检定研究院，北京 100050

芫花Genkwa Flos为瑞香科植物芫花DaphnegenkwaSieb.et Zucc.的干燥花蕾。其性温，味苦、辛，有毒[1]。在中国应用较为广泛，为传统峻下逐水药。药理研究表明，芫花具有利尿、镇咳、祛痰、抗肿瘤及免疫调节等作用[2-3]。由于其明确的抗肿瘤活性，临床长期应用所导致的不良反应屡次出现，其中，肝损伤所占比例最为严重[4-7]。

有学者通过血清生化指标和组织病理学筛选相结合的方法，初步证明芫花所致肝毒性部位集中在乙醇提取物的三氯甲烷萃取部分，其中芫花素含量较高。另有文献报道，芫花乙醇提取物中芫花素质量分数可高达6.06%。该实验同时采用体外方法证明，芫花醇提物可显著抑制大鼠肝微粒体(RLM)和人肝微粒体(HLM)中尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UDP-glucuronosyltransferases，UGTs)活性[8]，但醇提物中何种成分产生的抑制作用并未阐明，因此有待进一步考察研究。

UGTs酶是人体内重要的Ⅱ相代谢酶系，具有可催化脂溶性化合物及内源性物质的作用。被催化化合物多具有羟基、巯基、胺基、羧基和烯醇基团，经过UGTs酶系代谢后，这类物质水溶性增加，可随尿及胆汁外排出体外，从而防止其在体内蓄积产生毒性[9-10]。UGTs家族中非常重要的一员为UDP-葡萄糖醛酸转移酶1A1(UGT1A1酶)，该酶是内源性物质胆红素的唯一代谢酶。胆红素是人体内一种非常重要的内源性物质，是血红细胞的代谢产物，在临床上是判定黄疸的重要依据，同时也是肝功能和肝损害的重要生物标志物。因此通过考察药物对UGT1A1介导的胆红素葡萄糖醛酸结合的影响可用于预测该药物对肝脏是否具有潜在毒性作用。本实验拟在前期实验基础上，首先采用计算机分子对接手段初步预测芫花中主要单体成分芫花素对UGT1A1酶的活性影响，此外同时采用体外人肝微粒体温孵体系，评价其对UGT1A1酶的抑制作用，综合两部分实验结果对其潜在毒性进行初步评价。由于前期实验已经考察了芫花醇提物对不同种属中UGT1A1酶的抑制作用，并未见明显差异，因此本研究仅采用HLM进行实验研究[8]。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters AcquityTMUltra Performance LC超高效液相色谱仪(Waters公司，美国)，节能型职能恒温槽SDC-6(宁波新芝生物科技股份有限公司)，METTLER TOLEDO AE240型电子天平(梅特勒-托利多公司，瑞士)，Thermo 17R型高速低温离心机(Thermo公司，日本)。

1.2 材料与试剂

人肝微粒体(human liver microsome，HLM，50 donors)购自美国BD Gentest公司；磷酸钾(纯度≥98%)、抗坏血酸(纯度≥98%)、氯化镁(纯度≥98%)、三羟甲基氨基甲烷(Tris，纯度≥98%)、胆红素(纯度≥98%)均购自百灵威科技有限公司，丙甲菌素(纯度≥98%)、葡萄糖二酸单内酯(纯度≥98%)、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸(UDPGA，纯度≥98%)、二甲基亚砜(DMSO，纯度≥98%)均购自Sigma Aldrich公司，芫花素(批号：111899-201202，纯度：94.9%)购自中国食品药品检定研究院。甲酸、盐酸均为分析纯(北京化学试剂厂)，乙腈、甲醇均为色谱纯(Fisher公司)。

2 方法

2.1 同源模建

UGT1A1(Uniprot/P25101)是由534个氨基酸残基组成的Ⅱ相代谢酶，由于目前尚未确定UGT1A1的N-末端结构域，前期实验采用Discovery Studio 2.5 BLAST Search模块进行序列比对，分析其同源性、相似性高低，选择相似性最高的4种蛋白作为模板进行同源模建。实验应用Modeller 9.13程序，首先基于逐级能量最小化方法采用最陡下降法和共轭梯度法进行优化，约束所有重原子，优化氢原子、侧链及Loop区。其次基于拉氏图和Profile-3D分析对同源模建蛋白进行评价，最终构建出UGT1A1酶蛋白结构[11]。

2.2 分子对接实验

利用Discovery Studio 2.5的From Receptor Cavities模块对蛋白空腔进行自动识别，并利用活性值与打分值的相关性系数对活性口袋进行评价，分析待测单体芫花素与UGT1A1酶蛋白的作用方式，同时计算二者复合物结合自由能，用以判断亲和作用强弱。

2.3 人肝微粒体体外抑制实验

2.3.1 色谱条件 Acquity UPLC HSS C18(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；预柱：Acquity UPLC HSS C18VanGuard Pre-column(2.1 mm×5 mm，1.8 μm)；流动相：乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B)，梯度洗脱(0～2.1 min，40%A→75%A；2.1～4.2 min，75%A→95%A；4.2～8.0 min，95%A；8.0～8.5 min，95%A→40%A；8.5～12.5 min，40%A)；流速：0.4 mL·min-1；柱温：35 ℃；检测波长：450 nm；进样量：10 μL[12]。

2.3.2 UDPGA-发生系统的制备 精密称取丙甲菌素、氯化镁、葡糖二酸单内酯、UDPGA适量，加Tris-HCl缓冲液使溶解(Tris-HCl缓冲液：取Tris 121.1 g，加入去离子水800 mL，加浓盐酸调pH至7.4，去离子水定容至1000 mL)，其中含氯化镁5 mmol·L-1，丙甲菌素25 μg·mL-1，葡糖二酸单内酯5 mmol·L-1，UDPGA 5mmol·L-1，即得[12]。

2.3.3 孵育体系溶液的制备 采用人肝微粒体孵育体系(HLM)，以表观抑制常数Ki为评价指标，测定芫花素对UGT1A1酶的抑制作用。取蛋白质量浓度为0.5 mg·L-1的HLM 30 μL放至室温复融，分别加入系列浓度的胆红素(UGT1A1酶底物)对照品溶液(0.52～2.37 μmol·L-1)及待测单体芫花素对照品溶液(0.16～12 μmol·L-1)，置37 ℃ 恒温水浴预孵育3 min，加入新鲜配制的UDPGA-发生系统溶液68 μL启动反应。反应10 min后立即加入600 μL冰乙腈-甲醇(2∶1，含抗坏血酸浓度为200 μmol·L-1)沉淀蛋白终止反应，涡旋1 min后于13 000 r·min-1离心25 min，取上清液进行测定[DMSO总用量不超过1%(V/V)][13-14]。

3 结果

3.1 UGT1A1酶蛋白活性区确定

利用Discovery Studio 2.5的From Receptor Cavities模块对UGT1A1蛋白空腔进行自动识别，共获得9个口袋(A-I活性口袋)，坐标及半径如表1所示。

表1 结合位点信息表

3.2 分子对接实验结果

将单体芫花素(结构见图1)与UGT1A1酶蛋白进行对接，选择能够接纳化合物且相关系数相反数最大的口袋作为活性口袋。对接结果显示，芫花素在site F的打分值为81.643 7，高于其他活性位点的打分值，因此芫花素的结合口袋确定为site F(对接模式见图2)。

图1 芫花素结构图

图2 芫花素与UGT1A1酶对接模式图

在确定芫花素对接区域后，采用Discovery Studio 2.5中CDOCKER打分功能，对其与靶标蛋白UGT1A1的结合位点进行结合自由能(IE，kcal·mol-1)分析，IE值绝对值越大，代表体系能量越稳定，结合能力更强。由实验结果可知，芫花素与UGT1A1的 IE 值为31.303 4 kcal·mol-1，证明其与酶的结合能力较强；同时，前期实验[11]表明胆红素结合活性区为F区，与芫花素存在竞争结合的可能，因此进一步提示芫花素对于UGT1A1酶结合底物胆红素存在较大影响，具有一定的安全性风险。

3.3 人肝微粒体体外抑制实验结果

分别以胆红素总代谢产物(单葡萄糖醛酸胆红素及双葡萄糖醛酸胆红素)生成量对底物胆红素浓度做图，以米氏方程双倒数做图法进行计算测定，横坐标为胆红素浓度的倒数(1/S)，纵坐标为加入芫花素后胆红素代谢反应速率的倒数(1/V)；加入不同浓度芫花素对应不同曲线，将不同曲线的斜率对应相应底物胆红素浓度绘制slop图(图3)，求得抑制常数Ki[12，15]。由实验结果可知，芫花素的Ki值为27.0 μmol·L-1，对UGT1A1酶表现为中强抑制作用，由图3可知抑制类型为竞争型抑制，证明芫花素可与底物胆红素竞争性结合UGT1A1酶，继而抑制其酶活性，体外实验结果与计算机对接结果相一致。

注：A.米氏方程双倒数图；B.slop斜率图。图3 芫花素对UGT1A1酶动力学参数的影响

4 讨论

内源性物质胆红素在人体内的代谢及调节为一复杂生理过程[16]，任何环节发生病理改变均可导致胆红素代谢受阻、蓄积，继而引发肝毒性反应。目前已知UGT1A1酶为胆红素在体内的唯一代谢酶，因此本实验以此为切入点，从UGT1A1代谢酶抑制可引发潜在肝毒性反应为出发点，考察芫花中主要单体成分芫花素致肝毒性风险。

实验首先通过分子对接技术构建UGT1A1酶蛋白结构，将待测单体芫花素与UGT1A1酶蛋白对接，明确二者结合靶点以及结合强弱，初步推测芫花素与UGT1A1酶的结合位点为活性区F，与其底物胆红素活性位点重合，且芫花素与UGT1A1酶亲和性较强，因此提示芫花素可竞争型抑制UGT1A1酶代谢底物胆红素的酶活性，具有潜在肝毒性风险。另一方面，体外人肝微粒体实验结果显示，芫花素对人源UGT1A1酶具有中强抑制作用，抑制类型为竞争型抑制，与计算机分子对接结果相一致。

综上所述，本实验所构建的UGT1A1酶蛋白模型可用于药物的初期安全性评价筛选，可有效预测药物的潜在用药风险。计算机分子对接实验及体外人肝微粒体抑制实验均提示芫花素对UGT1A1酶存在抑制作用，可与其底物胆红素产生竞争型抑制，继而引发肝毒性。本研究将计算机模拟技术应用于预测药物潜在肝毒性风险的尝试，为中药安全性评价提供了新的思路。