VIP及VIP2型受体在儿童嗜酸性粒细胞增多性胃肠炎中的作用

孙丽丽

(中国医科大学附属本溪市中心医院，辽宁本溪 117000)

嗜酸性粒细胞增多性胃肠炎是以胃肠道嗜酸性粒细胞异常浸润为主要表现的胃肠道疾病，多发于14岁以下儿童，且发病率呈逐年上升趋势［1］.目前关于嗜酸性粒细胞增多性胃肠炎的发病机制尚未明确，研究［2-3］认为与免疫功能异常、变态反应、遗传因素、药物等因素有关.血管活性肠肽(Vasoactive Intestinal Peptide，VIP)是一种分布于胃肠黏膜中的非肾上腺素能非胆碱能神经递质，具有舒张血管、调节免疫、舒张平滑肌等活性，在维持胃肠道正常生理功能方面发挥重要作用［4］.研究［5］发现:慢性特发性荨麻疹发病过程中VIP能够特异性作用于VIP2型受体，调控肥大细胞脱颗粒.亦有研究［6］显示:哮喘患者经雾化吸入VIP后可有效减轻临床症状和气道平滑肌厚度，在抑制气道重塑方面效果明显.但VIP及VIP2型受体在嗜酸性粒细胞增多性胃肠炎中的作用仍鲜有报道.本研究采用免疫组化法检测嗜酸性粒细胞增多性胃肠炎患儿胃窦黏膜组织中VIP，VIP2型受体的表达情况，分析其与嗜酸性粒细胞数量及IgE水平的关系，旨在探讨VIP，VIP2型受体在儿童嗜酸性粒细胞增多性胃肠炎发病中的作用.

1 对象与方法

1.1 研究对象

前瞻性纳入2017年1月—2018年10月中国医科大学附属本溪市中心医院收治的嗜酸性粒细胞增多性胃肠炎患儿40例为观察组，均符合Talley在美国明尼苏达州的分型标准，对具有腹胀、腹泻、恶心呕吐等症状的患儿行外周血嗜酸性粒细胞计数、IgE水平测定以及电子胃镜检查;其中，男32例，女8例;年龄5个月～14岁，平均(6.2 7±2.61)岁.收集同期接受胃镜下病理活检未见异常的儿童40例为对照组，外周血嗜酸性粒细胞计数＜10个/高倍视野，IgE水平正常;其中，男30例，女 10 例;年龄 8 个月～14 岁，平均(6.04±2.97)岁.两组受试者性别、年龄之间比较差异无统计学意义(P＞0.05).本研究经医院伦理委员会批准，受试儿童及其监护人均自愿参与本研究，且签署知情同意书.

1.2 方 法

1.2.1 外周血嗜酸性粒细胞及IgE水平检测

收集两组受试儿童清晨外周静脉血2 mL分装至两个EP管中，其中一份使用贝克曼LH750型全自动血细胞分析仪进行嗜酸性粒细胞计数;另一份3 000 r/min离心10 min，取上层血清，酶联免疫吸附法(试剂盒:江苏宝莱生物科技有限公司)测定IgE浓度，操作严格按试剂盒说明进行.

1.2.2 标本收集与制备

受试儿童接受电子胃镜(日本奥林巴斯EVIS LUCERA 260型)检查，留取胃窦黏膜组织标本，放入4%的多聚甲醛中固定，梯度酒精脱水，二甲苯透明，常规石蜡包埋，4 μm连续切片，60℃烤片，常温保存.

1.2.3 嗜酸性粒细胞HE染色

取标本切片脱蜡至水，分别使用二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ脱蜡10 min，按顺序放入梯度酒精中各5 m in，自来水冲洗，苏木精染色5 min，冲洗后5%醋酸分化1 min，冲洗后放入0.6%氨水中返蓝，自来水冲洗后放入伊红染液中2 min，依次放入梯度酒精各30 s，二甲苯1 min，中性树胶封片.光学显微镜下随机选取5个视野进行嗜酸性粒细胞计数，观察组嗜酸性粒细胞＞20个/HPF，对照组嗜酸性粒细胞＜10个/HPF.

1.2.4 免疫组化检测VIP及VIP2型受体表达

取标本切片，60℃烤片，20 min后二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水;磷酸缓冲液洗涤后放入枸橼酸盐缓冲液中高温修复抗原，室温下冷却后磷酸缓冲液洗涤;滴加内源性过氧化物酶抑制剂，室温下静置10 min;洗涤后滴加山羊非免疫血清封闭30 min，弃去封闭液;滴加鼠抗人VIP多克隆抗体、鼠抗人VIP2型受体多克隆抗体，均为1∶500倍稀释，4℃孵育过夜;磷酸缓冲液洗涤后滴加山羊抗兔IgG，1∶2 000倍稀释，室温下反应1 h，滴加DAB显色液，流水冲洗终止显色，苏木素复染4 min，流水冲洗返蓝;脱水、透明后中性树胶封片.光学显微镜下每张切任意选取3个视野，通过图像分析软件Image-Pro Plus7.0得到吸光度值.

1.3 统计学分析

应用SPSS 20.0软件处理数据，研究数据分别以均值±标准差(珋x±s)、百分率表示，行t检验、χ2检验，相关性进行Spearman分析，以 P＜0.05为差异具有统计学意义.

2 结 果

2.1 两组受试儿童外周血嗜酸性粒细胞及IgE水平

观察组患儿外周血嗜酸性粒细胞比例、嗜酸性粒细胞计数、IgE水平均明显高于对照组，差异具有统计学意义(P＜0.01).见表 1.

2.2 两组受试儿童胃镜下组织变化情况

胃镜下观察，观察组患儿黏膜充血水肿、溃疡、糜烂、结节样增粗的比例明显高于对照组，差异具 有统计学意义(P＜0.05).见表2.

表1 两组受试儿童外周血嗜酸性粒细胞及IgE水平Tab.1Eosinophils and IgE levels in peripheral blood of children in two groups(珋x±s)

表2 两组受试儿童胃镜下组织变化情况Tab.2 Analysis of tissue changes under gastroscopyof children in two groups n(η/%)

2.3 两组受试儿童胃窦黏膜组织中嗜酸性粒细胞数量

HE染色显示:观察组患儿胃窦黏膜组织中嗜酸性粒细胞数量明显增加.见图1.观察组嗜酸性粒细胞数量平均(43.05±20.71)个/HPF，其中 20～40个/HPF的患儿22例，41～60个/HPF的患儿14例，＞60个/HPF的患儿4例.对照组嗜酸性粒细胞数量平均(8.94±1.80)个/HPF;观察组嗜酸性粒细胞数明显多于对照组，差异具有统计学意义(t=26.381，P=0.000).

图1 两组受试儿童胃窦黏膜组织HE染色结果Fig.1 HE staining of gastric antrum mucosa of children in two groups(×200)

2.4 两组受试儿童胃窦黏膜组织中VIP及VIP2型受体表达情况

胃窦黏膜组织中VIP及VIP2型受体阳性表达为黄色或棕黄色.观察组VIP阳性表达的吸光度值明显低于对照组，差异具有统计学意义(P＜0.0 5);观察组VIP2型受体阳性表达的吸光度值明显低于对照组，差异具有统计学意义(P＜0.01).见图2，表 3.

图2 两组胃窦黏膜组织中VIP及VIP2型受体阳性表达Fig.2 Positive expression of VIP and VIP2 receptors in antral mucosa of two groups(DAB，×200)

表3 两组胃窦黏膜组织中VIP及VIP2型受体阳性表达的吸光度值Tab.3 Absorbance values of positive expression of VIP and VIP2 receptors in antral mucosa between two groups(珋x±s)

2.5 VIP及VIP2型受体表达与嗜酸性粒细胞数量、IgE水平相关性分析

Spearman相关性分析显示:观察组患儿胃窦黏膜组织中VIP阳性表达量与嗜酸性粒细胞数量呈负相关(r=－0.647，P＜0.01)，与 IgE 水平呈负相关(r=－0.759，P＜0.01);观察组患儿胃窦黏膜组织中VIP2型受体阳性表达量与嗜酸性粒细胞数量呈负相关(r=－0.817，P＜0.01)，与 IgE 水平呈负相关(r=－0.850，P＜0.01).

3 讨 论

儿童嗜酸性粒细胞增多性胃肠炎临床症状主要包括腹部胀痛、呕吐、便血等［7］.研究者根据嗜酸性粒细胞增多性胃肠炎浸润深度、累及部位分为3种亚型，分别为黏膜型、肌层型、浆膜型，可共存或单独存在［8］.本研究收集的40例嗜酸性粒细胞增多性胃肠炎患儿均存明显的消化道症状，以腹痛最为明显;以黏膜型为主，另有8例浆膜型，未发现肌层型，可能与胃镜下病理活检夹取的深度不够有关.相关研究［9］显示:急性胃肠炎患儿外周血嗜酸性粒细胞计数、IgE水平明显升高，且能够反映出病情的严重程度.本研究中观察组患儿外周血嗜酸性粒细胞比例、嗜酸性粒细胞计数、IgE水平均明显高于对照组，与上述研究报道一致，提示嗜酸性粒细胞增多性胃肠炎患儿亦存在嗜酸性粒细胞、IgE水平升高.目前嗜酸性粒细胞增多性胃肠炎诊断主要通胃镜下多点活检，且组织病理学检查1处及以上的嗜酸性粒细胞＞20 个/HPF［10］.本研究中酸性粒细胞增多性胃肠炎患儿胃镜下以黏膜充血水肿为主要表现，其次为溃疡、糜烂、结节样增粗.

VIP是广泛存在于中枢神经及胃肠壁内神经系统中的神经递质，由28个氨基酸构成［11］.有研究［12］显示:VIP在哺乳动物体内发挥胃肠道激素和神经肽的双重作用，能够扩张心脑血管、降低血压、舒张支气管平滑肌等.在消化系统中以舒张肠道平滑肌为主，并松弛食管下括约肌、肛门内括约肌、Oddi括约肌［13］.VIP 通过特异性受体发挥生物学活性，包括 VIP1型受体、VIP2型受体［14］.VIP1型受体分布于肝、肺、主动脉等外周组织中，VIP2型受体分布更广泛，在除肝脏、主动脉之外的所有组织中均有分布，为神经内分泌VIP受体.本研究显示:嗜酸性粒细胞增多性胃肠炎患儿的胃窦黏膜组织中VIP和VIP2型受体含量明显高于对照组.人胃肠道黏膜组织中分布有大量的VIP神经纤维，与肥大细胞、嗜酸性粒细胞相互作用，形成神经-内分泌-免疫网络.本研究中嗜酸性粒细胞增多性胃肠炎患儿胃窦黏膜组织中VIP和VIP2型受体含量均与嗜酸性粒细胞数量、IgE水平呈负相关.

综上所述，儿童嗜酸性粒细胞增多性胃肠炎的发生可能与胃窦黏膜VIP含量减少有关.结合相关研究报道，VIP可通过抑制血小板活化因子介导的嗜酸性粒细胞过氧化物酶活性增加，下调嗜酸性粒细胞脱颗粒，降低嗜酸性粒细胞与血管内皮细胞的黏附;推测其机制:胃黏膜VIP含量下降导致与嗜酸性粒细胞表面VIP2型受体结合减少，对嗜酸性粒细胞与胃窦黏膜血管内皮细胞的作用下降，导致胃窦嗜酸性粒细胞聚集并发生脱颗粒，分泌损伤性因子，从而诱发了嗜酸性粒细胞增多性胃肠炎.