缺血预适应对脑梗死患者血清凋亡相关因子水平的影响

崔东岳，袁基科，岳萃涛

(中国科技大学附属第一医院，安徽省立医院急诊科，安徽 合肥 233001)

急性脑梗死指的是脑血供突然中断后引起的脑卒中坏死[1]。多由供应脑部血液动脉出现粥样硬化、血栓形成，管腔狭窄甚至闭塞，使局部出现急性脑供血不足引起。发病机制与血管内皮受损、微血管基底膜破坏等密切相关[2，3]，故临床治疗以促进侧支循环形成、提高新生血管床密度、促进患者神经功能恢复为主要目的。缺血预适应(ischemic preconditioning，IP)[4]是通过给予一次或多次短暂、非致死性缺血刺激后，诱导脑组织产生内源性保护机制，使患者对更严重甚至致死性脑缺血损伤获得耐受性。大量实验研究证实，缺血预适应可显著减轻再次缺血带来的脑损伤，可使神经元凋亡减少，缺血灶缩小，功能障碍改善[5，6]，但具体的作用机制尚未完全阐明。基于此，本研究通过观察缺血预适应对脑梗死患者治疗效果、神经功能的影响，检测血清凋亡相关因子改善情况，初步探讨血清凋亡因子在脑梗死中的作用，总结如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料2017年1月至2018年5月我院神经内科住院部收治的84例急性脑梗死患者，入院时均经影像学检查证实为急性脑梗死。纳入标准：①首次发病，发病时间72 h内；②临床症状、实验室辅助检查确诊为急性脑梗死；③入院时美国国立卫生院神经功能缺损评分(NIHSS)评分4～20分；④患者自愿参与研究。排除标准：①头颅CT检查提示存在颅内出血；②既往有脑梗死病史，遗留神经功能缺损；③合并严重心、肝、肾等功能不全；④存在血液系统、凝血系统疾病；⑤研究前近1个月内怀孕、分娩、哺乳者。根据梗死前出现短暂性脑缺血发作(TIA)与否，分为对照组(未出现TIA)40例与观察组(出现TIA)44例。观察组根据短暂性缺血持续时间分为A组(≤10 min，15例)、B组(10～20 min，11例)、C组(21～60 min，10例)、D组(60 min以上，8例)。对照组男26例，女14例；年龄40～70岁[(55.82±8.17)岁]；梗死部位：基底核区22例，放射冠区12例，丘脑3例，小脑2例，脑干1例。观察组男28例，女16例；年龄40～68岁[(55.75±8.08)岁]；梗死部位：基底核区24例，放射冠区13例，丘脑4例，小脑2例，脑干1例。两组基础资料比较，差异无统计学意义(P> 0.05)。

1.2 方法

1.2.1治疗方法 5组给予相同治疗方法，包括：抗血小板聚集、降颅内压、保护脑组织细胞，降血压，维持水、电解质、酸碱平衡等。

1.2.2血清凋亡相关因子检测 分别于入院第1d，治疗完成后，采集患者静脉血3 ml，离心分离血清检测凋亡相关因子水平。以ELISA法检测B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、细胞色素C(Cyt)、P53、白介素-2(IL-2)含量。具体步骤如下：①试剂盒室温平衡20 min，根据操作说明稀释标准品，分别设空白孔、标准孔、待测样品孔，复孔各2孔。空白孔加样品稀释液100 μl，标准孔加入100 μl稀释好的标准品，待测样品100 μl。37 ℃孵育90 min。②弃去液体，每孔加入生物素化抗体工作液100 μl，37 ℃孵育1 h。③洗板3次并拍干后，每孔加酶结合物工作液100 μl，37 ℃孵育30 min。④洗板3次后，弃去孔内液体，每孔加TMB底物90 μl，37 ℃避光孵育15 min。⑤每孔加终止液50 μl，终止反应。以空白孔调零，450 nm波长测量各孔吸光度值。根据标准品浓度绘制标准曲线，计算血清凋亡相关因子水平。

1.3 观察指标①临床治疗效果。采用pullicino法计算治疗前后脑梗死体积，脑梗死体积(cm3)=长×宽×CT扫描阳性层数/2。②神经功能缺损改善情况。分别于治疗前及治疗后，采用NIHSS评分评价患者神经功能缺损程度。③预后评价。预后评价于脑梗死发病后第30 d进行，以日常生活活动能力量表(ADL)评价，0～20分为极严重残疾，21～45分为严重残疾；46～70分为中度残疾；71～95分为轻度残疾，96分及以上为正常。ADL评分标准Ⅰ级预后为≥46分，Ⅱ级预后<46分。④血清凋亡因子含量。包括：Bcl-2、Cyt、P53、IL-2等。

1.4 统计学方法采用SAS 9.3统计学软件处理数据，计量资料比较采用t检验，计数资料比较采用卡方检验，P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脑梗死灶面积比较5组治疗前梗死灶面积比较差异无统计学意义(P>0.05)。5组治疗后梗死灶面积显著小于治疗前(P< 0.05)，B组治疗后梗死灶面积显著小于对照组(P< 0.05)。见表1。

表1 脑梗死灶面积比较

*与对照组比较，P< 0.05

2.2 神经功能缺损改善情况比较5组治疗前NIHSS评分差异无统计学意义(P>0.05)。5组治疗后NIHSS评分显著低于治疗前(P< 0.05)。B组治疗后NIHSS评分显著低于对照组(P< 0.05)。见表2。

表2 NIHSS评分比较 (分)

*与对照组比较，P< 0.05

2.3 预后比较治疗后B组Ⅰ级预后比例显著高于对照组(P< 0.05)。见表3。

表3 预后比较 [n(%)]

*与对照组比较，P< 0.05

2.4 血清凋亡相关因子水平比较5组治疗前Bcl-2、Cyt、P53、IL-2水平差异均无统计学意义(P>0.05)。5组治疗后血清Bcl-2水平显著高于治疗前，Cyt、P53、IL-2水平显著低于治疗前(P< 0.05)。B组治疗后BCL-2水平显著高于对照组，Cyt、P53、IL-2水平显著低于对照组(P< 0.05)。见图1。

图1 治疗前后血清Bcl-2、Cyt、p53、IL-2水平比较

3 讨论

急性脑梗死为多见于中老年患者的神经系统常见病之一，致死率、致残率高[7，8]。发病机制尚未完全阐清，可能与下述机制有关[9]：动脉粥样硬化基础上血栓形成，引起局部脑动脉管腔狭窄闭塞，血液循环不足，最终导致神经元凋亡、脑卒中缺血坏死。患者可表现为单侧肢体瘫痪，头晕、失语等神经功能缺损症状，严重者可昏迷不醒。尽早恢复脑补血供，促进神经功能恢复，缩短神经功能损害进展时间为临床治疗的关键所在。临床研究显示[10]，大脑缺血发生时间超过一定时限后，再次恢复血流灌注后，神经元缺血性损伤可出现明显的加重过程，即缺血再灌注损伤。脑缺血预适应是在缺血性脑损伤发生前，给予大脑一次或多次短暂性、非致死性的缺血处理[11]，使机体获得对下一次缺血性刺激的耐受或免疫现象，表现为神经元凋亡减少，缺血灶面积缩小，脑组织损伤程度减轻等。

IP的脑保护机制尚未完全明确，多数学者认为[12，13]，IP可引起以腺苷为主的内源性递质的释放，通过与相关受体结合，激活信号转导通路，启动相关联的基因，抑制神经元坏死、凋亡等。IP对脑梗死患者血清凋亡相关因子水平的影响，尚未见报道。本研究中，笔者比较了不同缺血时间急性脑梗死患者的神经功能、梗死灶面积及预后，结果显示，5组治疗后梗死灶面积显著小于同组治疗前，B组治疗后梗死灶面积显著小于对照组，B组治疗后NIHSS评分显著低于对照组，治疗后B组Ⅰ级预后比例显著高于对照组，说明TIA持续时间在10～20 min时，缺血耐受的产生效果较强。TIA持续时间非此时间段内，几乎不产生缺血耐受。结合文献分析可能的原因为：时间过短无法激活缺血耐受相关机制，时间过长又可使细胞坏死而无法获得缺血耐受。

细胞凋亡为细胞在凋亡基因调控下，自主出现的有序死亡，为程序性细胞死亡。形态学特征表现为细胞体积缩小，胞质浓缩，核质固缩，DNA降解，形成多个凋亡小体而被吞噬。近年来的研究显示，在急性脑梗死的发生、发展中，神经细胞的凋亡具有重要的作用。缺血预适应是否可通过改善血清凋亡相关因子，发挥脑保护作用还有待进一步研究。本研究中，笔者检测了缺血预适应后，各组血清凋亡相关因子水平，包括：Bcl-2、Cyt、P53及IL-2。其中Bcl-2为膜整合蛋白[14]，定位于线粒体外膜、内质网膜、核膜上[15]，可使Bcl-2蛋白与Bcl-2家族的促凋亡蛋白形成异源二聚体，使促凋亡蛋白在细胞中的定位、分布保持稳定状态，抑制Cyt C的释放，抑制caspase级联反应，保护细胞不发生凋亡。Cyt、P53为重要的细胞凋亡相关因子，其中Cyt在细胞凋亡启动中具有重要作用[16]，进入细胞质后，可触发caspase及非caspase级联两种反应，引发细胞凋亡。P53基因为肿瘤抑制基因，可抑制肿瘤生长，诱导细胞凋亡及捕获G1周期[17]，通过阻滞细胞周期及诱导细胞凋亡发挥抗癌作用[18]。IL-2为常见的细胞因子，可促进T细胞介导的免疫应答，调节T细胞成熟、活化，参与机体免疫应答。可作用于T细胞，活化T细胞表面的IL-2受体，诱导T细胞凋亡[19，20]。5组治疗后血清Bcl-2水平显著高于同组治疗前，Cyt、P53、IL-2水平显著低于同组治疗前。B组治疗后Bcl-2水平显著高于对照组治疗后，Cyt、P53、IL-2水平显著低于对照组治疗后。说明10～20 min的缺血预适应可抑制细胞凋亡，可能为缺血预适应对急性脑梗死患者脑保护作用的机制。

综上所述，10～20 min的缺血预适应可显著缩小急性脑梗死患者梗死灶面积，改善神经功能缺损，提高预后，可能与提高血清Bcl-2水平，降低血清Cyt、P53、IL-2水平有关。