低氧诱导因子-1α和抑癌基因在骨肉瘤中的表达及其临床意义

梁爽

骨肉瘤多发生于青少年，其特点表现为早期转移，且最易出现肺部转移，一旦检测到转移病灶，则严重威胁患者生命健康[1]。临床主要采用截肢手术治疗，但手术实施不仅会影响肢体功能，还会影响患者心理健康。为改善患者预后，临床认为治疗关键在于早期诊断鉴别骨肉瘤，为靶向治疗提供指导依据。既往研究有提出，低氧诱导因子-1α(HIF-1α)和抑癌基因(PTEN)发生与某些恶性肿瘤发生发展密切相关，但关于其与骨肉瘤之间的相关性，临床研究较少[2]。本次研究表明，应用免疫组化法检测骨肉瘤中HIF-1α和PTEN，重点探究骨肉瘤发生发展中HIF-1α、PTEN水平以及相关性，为临床诊治提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取我院骨科从2017年1月到2018年2月接受骨肉瘤手术切除的骨肉瘤标本25例，且病理证实，术前患者均未经放化疗治疗。25例患者的临床资料，男18例，女7例，年龄8～60岁，平均年龄(34.0±2.5)岁，病理分级：低分化8例，中分化9例，高分化8例；组织学分型经Dahlin分型：软骨母细胞型7例，纤维母细胞型8例，骨母细胞型8例，其他类型2例，根据Enneking分期：Ⅰ期(低度恶性)6例，ⅡA期(高度恶性)7例，ⅡB期(高度恶性)5例，Ⅲ期(任何分级)7例。另选取同期病理科收集的软骨瘤标本20例对照研究，男12例，女8例，年龄10～72岁，平均年龄(33.8±2.2)岁。收集标本统一进行分割保存，在组织固定前将其从液氮中取出，之后放入到调配为4%多聚甲醛中，固定处理24～48 h，固定处理后从多聚甲醛中取出后，经PBS缓冲液漂洗，目的在清除固定中应用多聚甲醛溶液，避免影响后期研究结果。之后将标本包埋处理，连续做3 μm厚度切片。

1.2 方法 选择的试剂为鼠抗人PTEN单克隆抗体、鼠抗人HIF-1α单克隆抗体、SP试剂盒、DAB显色试剂盒。应用免疫组化SP法，具体内容为：首先烤片，组织切片放于68℃恒温箱中进行烘烤，持续时间20～30 min；第二步，脱蜡，将切片放于二甲苯中，浸泡2次，每次浸泡时间10 min；第三步，阻断，针对内源性过氧化物酶实施灭活，3%H2O237 ℃孵育10 min，经PBS冲洗3×5 min；第四步，抗原修复，放入到0.01M枸橼酸缓冲液(PH 6.0)中，加热到95℃，持续15～20 min，自然冷却至少20 min，之后经冷水对缸子进行冲洗，快速冷却到室温，经PBS冲洗3×5 min；第五步，应用正常羊血清工作液进行封闭，保持温度37℃10 min；第六步：加入抗4℃冰箱中经孵育过夜，PBS冲洗3×5 min，用PBS缓冲液取代一抗做阴性为对照组，滴入生物素作为二抗，在37℃环境下孵育30 min，PBS冲洗3×5 min；第七步：加入辣根过氧化物酶做标记，在37℃环境下孵育30 min，PBS冲洗3×5 min；第八步：经DAB/H2O2反应做染色处理，之后经自来水冲洗。苏木素进行复染，常规脱水处理后，保持干燥状态下，进行封片处理。整个实验操作过程中，严格遵照说明书操作进行。将已知阳性切片为对照组，PBS代替一抗为阴性对照组。

1.3 观察评价 染色试验结果为棕黄色，则判定为阳性。经显微摄像计算机进行系统分析，每个切片随机取5个视野(400倍)，检查结果无阳性细胞，则判定为阴性(-)，阳性细胞不足50%，则判定为阳性(+)，若阳性细胞数量超过5%，选择判定为强阳性(++)。

1.4 统计学分析 采用SPSS 20.0软件处理，实验数据计数资料经卡方检验，并对HIF-1α、PTEN表达做相关性分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HIF-1α、PTEN在骨肉瘤与骨软骨瘤中的表达(表1) 组织中HIF-1α阳性染色定位于肿瘤细胞核中，显示为棕褐色颗粒，两组HIF-1α阳性表达差异有统计学意义(P＜0.05)。PTEN阳性染色定位于肿瘤细胞浆中，显示为棕黄色颗粒，PTEN阳性表达率组间比较，差异有统计学意义(P＜0.05)，这表明HIF-1α、PTEN表达与骨肉瘤密切相关，HIF-1α在骨肉瘤中的表达扮演者癌基因角色，而PTEN则扮演着抑癌基因角色。

表1 HIF-1α、PTEN在骨肉瘤与骨软骨瘤中的表达(n)

2.2 骨肉瘤、软骨肉瘤中HIF-1α、PTEN表达相关性 骨肉瘤中HIF-1α、PTEN表达相关性分析，PTEN表达越高，则HIF-1α表达相应下降，反之，PTEN阳性表达水平低，则HIF-1α相对较高，HIF-1α水平随PTEN表达下降而呈现逐步升高的趋势，检验分析表明HIF-1α与PTEN间为负相关(表2)。软骨肉瘤中HIF-1α、PTEN表达相关性分析，PTEN表达与HIF-1α表达呈正相关性(表3)。

表2 骨肉瘤中HIF-1α、PTEN表达相关性(n)

表3 软骨肉瘤中HIF-1α、PTEN表达相关性(n)

3 讨论

骨肉瘤为一种常见非血液系统的原发性骨肿瘤疾病，多发生于四肢长骨干骺端，青少年比较多发常见。该疾病病情恶化发展快，具有较高的病灶转移率，一旦发生病灶转移，则大大降低患者的生存率，临床多采用手术治疗[3]。随着医疗技术水平的进步，外科手术、放化疗辅助等治疗方法获得长远发展，保肢手术治疗成为临床治疗骨肉瘤的主要方法，尤其是新辅助化疗联合保肢手术疗效显著，虽然可一定程度提高患者的生存率，但预后效果仍不理想[4-5]。

但当前临床缺乏对该疾病发病机制的认知了解，无法进行早期诊断、鉴别分期，若能明确骨肉瘤分子标志物，便可为临床诊治提供指导依据，这是当前临床重要的研究内容。缺氧诱导因子HIF-1是在人类肿瘤与多种动物中发现的具有高表达的转录因子，是细胞缺氧时稳定表达的蛋白质[6]。该物质为一种异源二聚体，包括α、β两个亚单位。研究发现，人体多肿瘤组织HIF-1α具有较高的表达水平，尤其是缺氧肿瘤组织中表达水平较高，与预后水平相关[7]。恶性肿瘤疾病发生发展中，肿瘤生长速度明显超过血管生长速度，会导致局部缺氧，诱发HIF-α表达[7-8]。HIF-α高表达激活下游设计肿瘤细胞增生、血管生成、糖代谢、肿瘤转移等靶基因作用，提高红细胞生成素，增强肿瘤细胞的氧运输能力；提高糖酵解能力；促肿瘤细胞增生，通过上述作用机制可有效发挥改善肿瘤细胞供氧、供血，促肿瘤生长作用。本次研究表明，骨肉瘤中HIF-α表达率为52.0%，这表明该指标在骨肉瘤的发生发展中起着重要作用。PTEN为当前第一个发现具有双重特异性磷酸酶活性抑癌基因，具有促使磷酸化的苏氨酸、丝氨酸、酪氨酸去磷酸化的作用，通过去磷酸化，而发挥有效的抑癌效果。本次研究表明，骨肉瘤组织中，PTEN阳性表达高于在骨软骨瘤组织中，临床可将PTEN基因表达下降作为疾病早期诊断、预后的重要分子指标[9-10]。而且研究分析HIF-α、PTEN的蛋白表达水平呈负相关，两者在骨肉瘤组织中表达具有拮抗作用。

综上所述，临床可通过联合检测HIF-α、PTEN用于骨肉瘤早期诊断、预后评估，这对于抑制骨肉瘤病情恶化发展具有重要意义。