NK细胞、T淋巴细胞、调节性T细胞检测在上消化道肿瘤病情评估中的价值

毛 菊，杨雯雯，陈 稳，沈国栋，徐婷娟，程 民，胡世莲

(中国科学技术大学附属第一医院肿瘤内科，安徽省立医院肿瘤内科，安徽省老年医学研究所肿瘤分子实验室，肿瘤免疫与营养治疗安徽省重点实验室，合肥 230001)

在肿瘤的发生发展过程中,免疫系统起着至关重要的作用。EHRLICH[1]提出免疫监视理论,认为免疫系统的一项重要功能是从人体中检测和消除肿瘤细胞。随着经济的发展、生活节奏的加快以及癌症发病率的不断攀升，我国上消化道肿瘤患者数量日益增长，上消化道肿瘤患者常伴有免疫功能障碍，机体的免疫功能状态影响肿瘤的发生发展以及预后。检测上消化道肿瘤患者外周血调节性T细胞、NK细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞的比例，对患者的机体免疫功能监测、临床治疗以及预后判断具有重要的指导意义。鉴于此，笔者检测102例上消化道肿瘤患者外周血中NK细胞、调节性T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞的比例，探讨上述细胞比例与患者临床分期之间的关系。报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016年6月至2017年4月中国科学技术大学附属第一医院收治的上消化道恶性肿瘤患者102例，按肿瘤分期分为2组：对照组45例，均为Ⅱ—Ⅲ期患者，男33例、女12例，年龄42～77岁、平均(63±1)岁，病理类型：食管癌11例、胃癌34例；观察组57例，均为Ⅳ期患者，男50例、女7例，年龄46～82岁、平均(63±1)岁，病理类型：食管癌24例、胃癌33例。2组患者的性别、年龄等一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 入选标准

纳入标准：1)所有病例均经病理学确诊符合食管癌或胃癌病理学诊断标准(参照2010版消化系统肿瘤WHO分类)[2-3]；2)未服用激素类药物或接受免疫抑制剂治疗；3)临床分期标准：食管癌、胃癌临床分期依据2017年第八版AJCC，TNM分期中T、N、M的定义分别为原发肿瘤T、区域淋巴结N、远处转移M，临床分期包括Ⅰ—Ⅳ期[2-3]。排除标准：1)未经明确诊断的食管癌或胃癌；2)明确诊断为食管癌或胃癌但未做全NK、T、Treg细胞检测者。

1.3 试剂与仪器

T细胞亚群检测试剂盒、NK检测试剂盒、调节性T细胞检测试剂(包括CD4-FITC、CD25-PE、CD127-Percp-cy5.5、CD45-APC)，上述试剂盒均购自美国Beckton Dickinson公司；使用BD FACS Calibur流式细胞仪(美国Beckton Dickinson公司)及Cellquest软件进行细胞检测与分析。

1.4 检测方法

1.4.1 调节性T细胞检测

取50 μL抗凝外周血加入流式管，再向流式管中依次加入CD4-FITC、CD25-PE、CD127-Percp-cy5.5和CD45-APC抗体，避光孵育15 min；加入500 μL BD溶血素混匀，避光10 min，2000 r·min-1，5 min离心，弃上清；加入1 mL PBS溶液重悬，2000 r·min-1，5 min离心，弃上清；使用300 μL PBS溶液重悬细胞，上机检测。

1.4.2 NK细胞检测

取50 μL抗凝外周血加入流式管，再向流式管中加入20 μL CD3-FITC/CD16+CD56-PE抗体，避光孵育15 min；加入500 μL BD溶血素混匀，避光10 min，2000 r·min-1，5 min离心，弃上清；加入1 mL PBS溶液重悬，2000 r·min-1，5 min离心，弃上清；使用300 μL PBS溶液重悬细胞，上机检测。

1.4.3 T淋巴细胞亚群检测

取50 μL抗凝外周血加入流式管，再向流式管中加入20 μL CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PERC P/CD4-APC抗体，避光孵育15 min；加入500 μLBD溶血素混匀，避光10 min，2000 r·min-1，5 min离心，弃上清；加入1 mL PBS溶液重悬，2000 r·min-1，5 min离心，弃上清；使用300 μL PBS溶液重悬细胞，上机检测。

1.5 统计学方法

2 结果

与对照组相比，观察组外周血调节性T细胞的比例差异无统计学意义(P>0.05)，外周血CD4+T细胞比例明显降低，外周血CD8+T细胞比例、NK细胞比例明显增高，差异均有统计学意义(均P<0.05)。见表1。

表1 2组NK细胞、T淋巴细胞亚群及调节性T细胞比例比较

3 讨论

肿瘤的发生与内外环境各种因素的综合作用相关，正常细胞受到有害刺激，恶性突变成癌细胞，继而持续扩增形成肿瘤组织[4]。恶性肿瘤患者常伴有机体免疫功能的异常，作为细胞免疫最重要的T淋巴细胞通过功能各异的T淋巴细胞亚群来发挥免疫调控作用[5]。在上消化道肿瘤的发生、发展过程中，机体的免疫功能也发生了显著改变，主要表现为免疫防御和免疫监视功能的降低。随着对肿瘤免疫机制的不断探索和肿瘤免疫营养治疗的应用，较多的细胞免疫检测指标用于判断肿瘤患者的疾病状态、治疗效果及预后，其中调节性T细胞、NK细胞、T细胞亚群的测定较为常用。

调节性T细胞是具有一定免疫抑制功能的T细胞亚群，即是一群CD4+CD25+CD127low T细胞。NK细胞(CD3-CD16+/CD56+)是非抗原依赖性免疫效应细胞，可以不经致敏直接杀伤肿瘤细胞[6]，具有抗肿瘤免疫，与细胞毒性T淋巴细胞在机体免疫防御方面发挥着重要的作用[7-8]。研究表明在胃癌中重建NK细胞功能可以很好地预防肿瘤免疫逃逸，是机体免疫监视系统的重要组成部分，也是机体抗御感染和防止细胞恶性转化的重要免疫调节细胞[9]。T细胞可分为Th(CD3+CD4+)和Ts(CD3+CD8+)细胞。若T细胞总数或CD4+/CD8+T细胞比值降低，即可视为免疫调节功能紊乱，易发生肿瘤或自身免疫病。已有研究显示，调节性T细胞，NK细胞，T淋巴细胞亚群测定是反映肿瘤患者的机体免疫功能状态常用指标[10-11]。王祝荣等[13]选取226例宫颈癌患者和同期健康体检者60例女性作为对照组,结果表明T淋巴细胞亚群与NK细胞水平可反映宫颈癌患者的细胞免疫功能,且宫颈癌临床分期越晚,细胞免疫功能越低。王勇[14]认为测定恶性肿瘤患者外周血中T淋巴细胞亚群数目变化对临床确定治疗方案及疗效观察具有一定意义。肿瘤微环境中的T淋巴细胞具有至关重要的免疫监视作用[15]。钟锐等[16]认为晚期胃癌患者外周血中Treg(CD4+CD25+CD127low)细胞的表达水平明显高于健康体检者，且化疗后降低，有助于判断化疗疗效。赵强等[17]认为食管癌外周血Treg(CD4+CD25+CD127low)细胞比例能较敏感、特异地反映其细胞免疫功能状态，有可能成为反映食管癌免疫状态及疾病进展的外周血标志物。

本研究中Ⅳ期上消化道肿瘤患者Treg细胞的表达水平与Ⅱ、Ⅲ期相比没有统计学差异，可能与本研究中病例数不够以及将胃癌、食管癌整合在一起分析的因素相关。本研究结果显示上消化道肿瘤临床Ⅳ期患者CD4+T细胞的比例较Ⅱ、Ⅲ期患者明显降低，CD8+T细胞和NK细胞比例较Ⅱ、Ⅲ期患者明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)，说明不同临床分期的肿瘤患者外周血免疫状态存在差异，临床Ⅳ期患者的免疫功能比Ⅱ、Ⅲ期患者更差。当上消化道肿瘤患者的CD4+T细胞的比例明显降低，CD8+T细胞比例明显升高且调节性T细胞比例升高时表明患者目前的免疫力较差，在治疗中需要考虑改善患者免疫力如采用肿瘤免疫营养支持治疗的方法。通过检测上消化道肿瘤患者外周血NK、T、调节性T细胞可以较早评估患者免疫状况，对临床诊疗活动具有一定的指导意义。综上所述，检测上消化道肿瘤患者外周血调节性T细胞、NK细胞、T淋巴细胞的比例，有助于发现上消化道肿瘤患者的免疫功能是否存在异常，进而指导临床医生对上消化道肿瘤患者的病情判断、治疗方案的制定及预后评估。