细胞分裂周期蛋白 42 在帕金森病模型小鼠认知功能障碍中的作用*

温二生，杨柳珍，钟晓鹏，邱 甜，游 静，余子云，黄志华，薛进华，陈 涛

(赣南医学院基础医学院 1.2017级本科生；2.2016级本科生，江西 赣州 341000)

帕金森病(Parkinson's Disease, PD)是常见的与年龄相关的中枢神经系统退行性疾病，由于人口老龄化加剧，我国PD患者数量逐年增加。流行病学调查结果显示，65岁以上人群PD的发病率高达1.7%[1]。PD患者在临床上主要有肌肉僵直、运动迟缓、静止性震颤等运动症状和焦虑、抑郁、自主神经功能紊乱以及认知功能障碍等非运动症状，认知功能障碍常发生在PD早期阶段[2-3]，PD患者约25%合并轻度认知功能障碍，最终约80%发展为轻度认知障碍和帕金森病痴呆[4]。PD认知功能障碍的发生机制还不清楚，可能与海马区神经元的树突可塑性改变有关。小GTP酶Rho家族主要包括细胞分裂周期蛋白 42 (cell division cycle 42, Cdc42)，Ras相关C3肉毒菌毒物底物1 (Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1, Rac1)和Ras同源成员A (Ras homologous member A, RhoA)，在神经过程的起始、生长、引导和分支中起着关键作用[5]，可通过影响肌动蛋白细胞骨架的组装和稳定性来调节神经元的形态发生[6]。RhoA能够抑制神经突的延伸，而Cdc42和Rac1是神经突向外生长的正调节因子，其中Cdc42能够调节细胞周期，促进细胞的增殖，以及调节肌动蛋白骨架重组影响细胞的运动，另外Cdc42还可以通过促进肌动蛋白的形成有利于神经元的存活和再生。最近的研究表明PD的病理生理学的改变与Cdc42信号传导密切相关[7]。本实验用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine, MPTP)制备PD小鼠模型，研究Cdc42在PD小鼠海马区的变化，并探讨Cdc42在PD认知功能中的作用。

1 材料与方法

1.1实验动物C57BL/6鼠， 8～12周龄，雄性，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司[许可证号：SCXK(湘)2016-0002]，常规鼠笼饲养，恒温恒湿，12 h昼夜节律控制，自由进食和饮水。本实验设计和所有操作步骤均符合动物伦理。

1.2试剂及药物高镁离子蛋白裂解液(MLB)，lgepal CA-630，NaF，EDTA，leupeptin，aprotinin购自广州捷倍斯生物科技有限公司；OCT 包埋剂购自Miles Scientific 公司；BCA 法蛋白检测试剂盒，碧云天；ECL 曝光液，Millipore 公司；mouse anti Cdc42：BD 公司； rabbit anti Cdc42：Millipore 公司； mouse anti Cdc42：Santa 公司；HRP 二抗购自Dako 公司。

1.3实验方法

1.3.1PD小鼠模型的制备将MPTP·HCl溶于无菌生理盐水中，以30 mg·kg-1的剂量，腹腔注射5天，制备PD小鼠模型[8]。

1.3.2动物分组及药物处理Control组：每天一次，连续5天腹腔注射生理盐水，注射剂量与MPTP相同。MPTP组： 每天一次，连续5天腹腔注射MPTP·HCl (30 mg·kg-1)。

1.3.3新物体识别实验实验在规格为25 cm×25 cm×25 cm的箱体中进行。实验分为适应阶段、训练阶段和测试阶段，为期3天。所有的设备在不同小鼠和阶段都用水清理干净。测试阶段采取双盲法记录5 min，小鼠在示例物体或新物体1 cm 范围内的活动时间为探索时间，去除小鼠站立在物体上的时间。

1.3.4改良Y-迷宫实验改良Y-迷宫实验基于动物对未探索区域的先天偏好，评估短期空间记忆能力。Y迷宫的三个臂由木板(长18 cm，宽6 cm，高6 cm)组成，离地面高度50 cm。实验包括两部分：训练和测试，各8 min，两部分实验间隔120 min。训练阶段，关闭一个臂(“新奇”)，将小鼠从其他两臂的一个臂末端(“起始”)面向中心放入，让其在起始和其他臂之间选择。训练完成后，将小鼠取出，单笼放置120 min。测试阶段，打开“新奇”的臂，再次从起始臂放入小鼠，让其对三个臂自由探索8 min，记录进入新打开臂的次数和停留时间。

1.3.5Westernbloting测定海马区Cdc42的表达取新鲜的海马组织，用细胞裂解液裂解组织，4 ℃，12 000 g离心5 min，BCA法蛋白定量，SDS/PAGE凝胶电泳，然后转移至PVDF膜，室温封闭，孵育一抗置于4 ℃过夜，室温孵育二抗1 h，化学发光，采集数据并进行灰度扫描分析。

1.3.6免疫组织化学染色10%水合氯醛麻醉小鼠，用4%多聚甲醛心脏灌注，快速取脑，4%多聚甲醛6～8 h，20%蔗糖过夜，30%蔗糖过夜，切片，厚度30 μm，漂片法进行免疫组织荧光染色。

2 结 果

2.1PD模型小鼠认知能力的影响新物体识别实验结果显示，PD模型小鼠对新物体的探索时间明显减少，与对照组相比，差异有统计学意义(P<0.01)；改良Y迷宫实验结果显示，PD小鼠在新开放臂停留的时间显著减少，与对照组相比，差异有统计学意义(P<0.01)(图1)。

2.2海马神经元树突棘密度的变化取海马区进行免疫荧光染色，计数CA1区神经元树突棘密度，结果如图2所示，PD模型小鼠CA1区神经元树突棘密度显著降低，与对照组相比，差异有统计学意义(P<0.01)。

2.3PD模型小鼠海马区Cdc42活性的变化在最后一针MPTP后24 h取海马区组织进行GST pull-down实验，检测活化的Cdc42活性，结果显示(图3)，MPTP诱导的PD模型小鼠海马区活化Cdc42的活性降低，与对照组相比，差异有统计学意义(P<0.01)。

注：**P<0.01，与对照组相比，n=9，t=4.6，P=0.0003。

注：**P<0.01，与对照组(n=7)相比，MPTP组(n=6)t=6，P<0.01。

注：**P<0.01，与对照组相比，n=4，t=5.406，P=0.0029。

3 讨 论

PD是常见的与年龄相关的中枢神经系统退行性疾病，由于人口老龄化加剧，我国PD患者数量逐年增加。以往对PD的研究主要针对其运动症状，但是近年来的研究发现，认知功能障碍常发生在PD运动症状之前，主要有空间学习记忆和物体识别受损等表现[9]，其发生机制还不清楚。

海马是与学习和记忆密切相关的重要脑区，也是人们研究学习、记忆最广泛的区域，临床研究发现PD患者海马体积缩小[10]，海马区神经元呈现进行性减少趋势[11]。海马神经元树突重塑异常在多种疾病的发生发展中起重要作用，但是在PD认知功能障碍发病机制中的研究鲜有报道。本实验结果显示PD模型小鼠海马CA1区神经元树突棘密度显著降低。树突棘是神经元突触结构形成的基础，树突棘密度的减少必然会影响突触间的信息传递。Cdc42是小G蛋白Rho家族的重要成员，参与细胞骨架、细胞增殖与迁移的调控过程，Cdc42主要定位表达于神经元树突棘，而激活的Cdc42局限于活化的树突棘，我们的研究结果显示PD模型小鼠海马CA1区树突棘密度减少，活化的Cdc42活性也降低，因此Cdc42可能参与树突棘的重塑。综上所述，PD模型小鼠认知功能障碍可能与海马区活化的Cdc42活性降低导致树突棘密度减少有关。