中华鳖GnRH 1基因cDNA克隆及表达特征

申 慧，张英萍，王利华，沙 航，王咏星，邹桂伟，梁宏伟

(1.新疆大学生命科学与技术学院，乌鲁木齐 830046；2.中国水产科学研究院长江水产研究所，武汉 430223；3.上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306)

促性腺激素释放激素(Gonadotropin-releasing hormone,GnRH)是由下丘脑分泌的，动物生殖过程中最重要的激素之一，在脊椎动物的性腺发育、繁殖功能维持中起着重要的作用。它是下丘脑-垂体-性腺(hypothalamic-pituitary-gonadal,HPG)轴的关键信息分子；由下丘脑接收的信息以间歇性脉冲的形式来分泌GnRH，从而刺激垂体前叶分泌促性腺激素(Gonadotropin,GTH)，即促卵泡素(follocle-stimulating hormone,FSH)和黄体生成素(luteinizing hormone,LH)，进而促进睾丸或卵巢的发育并分泌睾酮(testosterone,T)或雌二醇(estrogen,E2)，从而调节性激素的分泌[1]，调控性腺影响配子的发育与成熟[2-3]。脊椎动物中大多数物种至少存在两种促性腺激素释放激素，硬骨鱼中一般存在3种类型的促性腺激素释放激素。促性腺激素释放激素来源和定位的不同，也造成了不同类型促性腺激素释放激素在功能方面的差异。脊椎动物具有多个GnRH亚型，分为三个主要组分，即GnRH1、GnRH2和GnRH3[4]。一般认为存在于下丘脑的组织特异性GnRH为GnRH1，即sbGnRH，主要作用是刺激促性腺激素的释放。GnRH2在结构上高度保守，包含由中脑神经元表达的所有GnRH形式，主要调节性行为和摄食行为。GnRH3目前只在硬骨鱼中被发现，由位于腹侧前脑的神经元表达，且已被证明其发挥神经调节功能[5-6]。

中华鳖(Pelodiscussinensis)作为我国重要的水产名优经济动物,2016年全国的养殖产量约34.5万吨，已成为我国渔业结构优化、农民增收致富的重要养殖对象之一[7-8]。中华鳖养殖业快速发展的同时，由于养殖户的盲目引种、不科学的配组繁殖，使得中华鳖生长速度减慢、群体整齐度降低和畸形率增加，严重制约其产业的发展[9]。中华鳖属于分批产卵的卵生爬行动物，相比较鱼来说，产卵量少，繁殖效率较低，因此对其繁殖机理的研究不仅有利于改善其繁殖性能，也有利于中华鳖新品系(种)的培育。本试验以中华鳖GnRH1基因为研究对象，对其在不同性别、不同组织和胚胎发育过程中的表达特征进行分析，为今后GnRH基因在中华鳖生殖调控等方面的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验所用中华鳖收集自安徽省喜佳农业发展有限公司，选取健康且活力好的1龄中华鳖雌雄个体各3只，其中雄性(395.36±20.55)g，雌性(283.72±18.02)g，活体经麻醉后，解剖采集脑、心脏、肝脏、脾脏、肺、肌肉、肠、卵巢或精巢等8组织样品；参照Tokita等[10]对中华鳖胚胎发育过程的分期，选取30 ℃孵化条件下中华鳖发育的第8期、第10期至第18期共10个时期的胚胎，每时期均取3个重复样本；样品于液氮罐中保存过夜后转至-80 ℃保存。

1.2 总RNA提取及cDNA的合成

取保存的雄性中华鳖脑组织，根据Trizol试剂说明书提取总RNA，用核酸蛋白定量仪(Nanodrop 2000 Thermo Scientific，美国)检测提取的RNA浓度并用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。使用PrimeScriptTMRT Reagen Kit with gDNA Eraser(TaKaRa，大连)合成cDNA，同时使用SMARTerTMRACE 5′、3′ Kit(TaKaRa，大连)分别合成5′、3′ RACE cDNA模板，-20 ℃保存。

1.3 中华鳖GnRH 1基因全长cDNA的克隆

根据GenBank中华鳖GnRH1基因mRNA预测序列(XM_014569063.2)，设计克隆GnRH1基因中间片段引物(表1)。PCR体系参考PCR Master Mix试剂说明书(20 μL)，反应条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，35个循环；72 ℃ 3 min，4 ℃保存。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，送至武汉天一辉远生物科技有限公司测序。根据获得的GnRH1基因中间序列设计用于5′ 和3′ RACE扩增的引物(表1)。3′ RACE采用引物GnRH1-3′ outer和试剂盒提供的接头引物3′ adapter进行第一轮PCR扩增，接着以引物GnRH1-3′ inner和3′ adapter进行巢式PCR二轮扩增。5′ RACE采用引物GnRH1-5′ outer和试剂盒接头引物5′ adapter以加尾的cDNA为模板进行第一轮PCR扩增，然后以GnRH1-5′ inner引物和5′ adapter进行巢式PCR第二轮扩增。PCR目的条带纯化回收后连接到pUC-19T载体，后转化至DH5α感受态细胞中培养，挑取阳性克隆送至武汉天一辉远生物科技有限公司测序。

1.4 中华鳖GnRH 1基因全长及序列分析

将克隆得到的片段通过DNAMAN软件进行拼接，并用ORFfinder(https://www.ncbi.nlm.n ih.gov/o-rffinder/)在线工具预测基因的开放阅读框(ORF)位置；然后利用Expasy-ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)将其翻译为氨基酸序列并预测蛋白的相对分子质量和等电点；采用在线工具SignaIP 4.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/Sign-alP/)和TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)分别对其信号肽以及跨膜区进行预测；利用Net-Phos 3.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)预测氨基酸功能位点；使用DNAMAN软件对中华鳖GnRH1及其同源氨基酸序列进行比对；使用Prabi-Geland在线工具(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopm.html)预测氨基酸的二级结构；使用SWISS-MODEL在线工具(https://www.swissmodel.expasy.org/)构建蛋白三维模型。

表1 中华鳖GnRH 1基因序列扩增引物信息

1.5 中华鳖GnRH 1系统发育分析

从GenBank下载墨西哥箱龟(Terrapenemexicanatriunguis,XP_024067919.1)、西部颈龟(Chrysemyspictabellii,XP_005285222.1)、绿海龟(Cheloniamydas，EMP30498.1)、美国短吻鳄(Alligatormississippiensis，KYO44455.1)、扬子鳄(A.sinensis，XP_014377775.1)、原鸡(Gallusgallus，NP_001074346.1)、绿头鸭(Anasplatyrhynchos，XP_012959602.1)、卡氏小鼠(Muscaroli，XP_021038275.1)、人(Homosapiens，NP_000816.4)、牛(Bostaurus，NP_001071605.1)、马(Equuscaballus，XP_003364546.3)、非洲象(Loxodontaafricana，XP_023406765.1)、白鲸(Delphinapterusleucas，XP_022450743.1)、帝王鲑(Oncorhynchustshawytscha，XP_024296453.1)、银大马哈鱼(Oncorhynchuskisutch，XP_020344148.1)、斑马拟丽鱼(Maylandiazebra，XP_004544170.1)、大黄鱼(Larimichthyscrocea，KKF17334.1)、青鳉(Oryziaslatipes，NP001098169.1)、黄鳝(Monopterusalbus，XP_020446236.1)等20种物种的GnRH1氨基酸序列，利用MEGA 7.0软件经Clustalw序列比对后，以邻接法(Neighbor-Joining)1 000次bootstraps，构建基于GnRH1氨基酸序列的分子系统进化树。

1.6 GnRH 1基因mRNA在中华鳖不同组织及不同发育时期的表达特征

以雌雄个体不同组织和不同发育时期胚胎的cDNA作为荧光定量PCR(qRT-PCR)模板，依据中华鳖GnRH1基因设计qRT-PCR引物，18s rRNA内参基因引物采用已发表序列[11](表1)。利用ABI 7500荧光定量PCR仪检测GnRH1 mRNA相对表达情况，每个样品重复3次。PCR反应体系为20 μL：2×SYBR Premix ExTaq 10 μL，10 μmol/L 上下游引物各 0.4 μL，ROX Reference DyeⅡ 0.4 μL，cDNA 2 μL，超纯水 6.8 μL；扩增程序为；95 ℃预变性 30 s；95 ℃变性10 s，60 ℃退火34 s，共40个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃退火 60 s，95 ℃ 15 s。结果采用2-ΔΔCt方法进行分析，数据分析利用SPSS 22.0软件中的单因素方差分析，差异显著性以P<0.05为标准，数据结果用平均值±标准差(mean±SD)表示。

2 结果

2.1 中华鳖GnRH 1基因的克隆及序列特征

克隆获得的中华鳖GnRH1基因全长cDNA共为546 bp，5′ UTR区99 bp，3′ UTR区168 bp，编码区279 bp，含有1个加尾信号序列AATAAA(491 bp处)及PolyA(30 bp)尾，共编码92个氨基酸；具有N端信号肽(1～23 aa)、核心十肽区域(24～33 aa)和相关肽区域(37～92 aa)，以及断裂位点GKR(34～36 aa)，符合GnRH蛋白典型结构特征(图1)。

图1 中华鳖GnRH 1 cDNA 序列及其推导的氨基酸序列Fig.1 GnRH 1 cDNA sequence and putative amino acid of P.sinensis

2.2 中华鳖GnRH 1氨基酸序列

采用MEGA 7软件构建基于中华鳖GnRH1和其他20个物种氨基酸序列的系统进化树(图2)。结果表明，中华鳖首先与龟鳖目的墨西哥箱龟、西部颈龟、绿海龟聚为一支，然后与爬行纲的美国短吻鳄、扬子鳄再聚为一支，最后与鸟纲中的原鸡和绿头鸭聚在一起，5种哺乳纲物种和6个硬骨鱼纲物种均单独聚为一支。

图2 基于GnRH 1氨基酸序列的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree for different species based on GnRH 1 AA sequences“☆”表示中华鳖

2.3 中华鳖GnRH 1基因的生物信息学

中华鳖GnRH1 cDNA序列及其推导的氨基酸序列。起始密码子和终止密码子用灰色阴影部分标出，GnRH1信号肽用单下划线表示，断裂位点 GKR 用双下划线表示，GnRH1核心十肽置于方框内，GnRH1相关肽(GAP)用虚下划线表示，*表示终止密码子，波浪线代表3′非翻译区加尾信号AATAAA(图3)。

中华鳖GnRH1基因编码的蛋白质理论分子质量为10.23 kDa，分子式为C454H725N121O135S6，理论等电点pI为5.65，不稳定指数为53.10，脂溶指数为86.96，总平均疏水指数为-0.172，为亲水性蛋白。信号肽和跨膜区预测结果显示，该蛋白信号肽切割位点位于第23和24个氨基酸残基之间，N-端具有一个由23个氨基酸组成的信号肽以及一个跨膜区(7～29 aa)，为分泌蛋白；磷酸化位点有5个Ser，1个Thr，1个Tyr；无N糖基化位点。该蛋白二级结构中α-螺旋占68.48%，随机卷曲占20.65%，β-转角占6.52%。基于同源氨基酸构建的中华鳖GnRH1氨基酸三维模型(图4)，显示该蛋白为单链蛋白。

图3 GnRH 1氨基酸序列比对Fig.3 Multiple sequences alignment of GnRH 1 amino acidsquences from different species黑色标注保守氨基酸，红色标注相似性大于75%的氨基酸，蓝色标注相似性大于50%的氨基酸

图4 中华鳖GnRH 1蛋白三级结构模式图Fig.4 Tertiary structure pattern of GnRH 1 protein in P.sinensis

2.4 中华鳖GnRH 1基因表达特征

通过qRT-PCR对中华鳖GnRH1基因在雌雄不同种组织中的表达特异性进行分析，结果表明(图5)，GnRH1基因在所检测的8组织中均有表达，但表达量存在较大差异。雌性和雄性个体中GnRH1基因均在脑中表达量最高，在心脏中表达量最低，几乎不表达，在肠和脾脏组织中略有表达。在雌雄个体之间，在雄性脑和性腺中的表达量显著高于雌性(P<0.05)。中华鳖GnRH1基因在第8期、第10期至第18期10个发育时期胚胎中的表达情况如图6所示，GnRH1基因在第8期到第11期表达量很低，第12期开始表达量显著增高，并维持到第14期，第15期又出现显著增高，第16期表达量最高，然后呈下降趋势。

图5 中华鳖GnRH 1基因在成体组织的表达分析Fig.5 The expression of GnRH 1 in adult tissues of P.sinensis1：心脏；2：肝脏；3：肠；4：脑；5：肌肉； 6：性腺；7：肺；8：脾脏；*表示差异显著(P<0.05)；**表示差异极显著(P<0.01)

图6 中华鳖GnRH 1基因在胚胎各时期的表达Fig.6 The expression of GnRH 1 in different stages of embryo不同字母表示差异显著(P<0.05)

3 讨论与结论

本研究克隆获得的中华鳖GnRH1基因包括99 bp 5′端非编码区，279 bp完整编码区和168 bp 3′端非编码区，共编码92个氨基酸，核心十肽为QHWSYGLQPG。GnRH1基因编码蛋白含有一个由23氨基酸构成的信号肽，为分泌蛋白和亲水性蛋白，预测三维结构为单链蛋白，符合GnRH蛋白的典型特征，这与京海黄鸡GnRH1蛋白性质的研究具有相似的结果[12]。不同物种间GnRH1氨基酸序列具有较高的保守性，中华鳖与绿海龟的相似性最高为91%，与同为爬行纲的墨西哥箱龟、西部颈龟、美国短吻鳄和扬子鳄同源性分别89%、88%、75%和75%。系统发育表明，所分析的物种分为爬行类、鸟类、哺乳类及鱼类，与其分类地位一致，中华鳖与同为龟鳖目的绿海龟亲缘关系最近。研究表明GnRH1的信号肽和核心十肽部分非常保守，但在不同物种间，GAPs同源性很低[14]。GnRH1是促进性激素分泌的激素的主要形式，在不同物种中的特异性比较高，对个体性腺发育和配子生成有重要作用[9,13]。

在牙鲆、圆斑星鲽、美洲鲥鱼和许氏平鮋等众多物种中GnRH1基因的表达特征呈现出表达的普遍性，但在一些不同的物种中也存在差异[14-17]。美洲鲥鱼中GnRH1的表达呈现出性别二态性，雌性美洲鲥鱼脑组织中GnRH1的表达水平显著高于雄性，从生长上来看，雌性个体往往比雄性个体大，呈现出生长差异。Swapna等研究了GnRH1基因在罗非鱼雌雄间性的差异性表达发现，雄性罗非鱼GnRH分泌神经元比雌性提前出现10 d，数量上也高于雌性；雄性罗非鱼的生长速度快于雌性，且体型往往比雌性大，分泌时间与分泌水平表现出的差异，可能与性别的分化以及生长的速度有关[18]。在鱼类中，GnRH类似物可促进垂体中生长激素(Growth hormone，GH)的分泌与合成，提高鱼类的生长速率，给鲤、草鱼、罗非鱼和黑鲷等注射GnRH类似物可以提高其血清中的GH水平从而提高其生长速率[19-21]。本研究中中华鳖GnRH1表达呈现性别差异性，且在雄性个体的脑和性腺组织中的表达高于雌性，从二者的生长情况上来看，雄性个体往往比雌性大，呈现出生长上的差异，这与在美洲鲥鱼及罗非鱼中的研究类似[16，18]。

基于Tokita等[10]对中华鳖胚胎发育的分期，30 ℃孵化的第15 天处于胚胎发育处于第14期和第15期之间。本研究中中华鳖GnRH1在胚胎发育第15期表达量急剧上升，与李慧君[22]认为在第15天原始性腺形成的观点一致，表明该基因的表达与胚胎性腺发育有着密切关系。在美洲鲥鱼、大菱鲆、条纹鲈[16,23-25]等的研究中也发现GnRH1的表达与性腺发育存在周期间一致性变化，推测该基因在中华鳖中与性腺发育同样密切相关，后续将进行相关研究验证。

本研究克隆获得了中华鳖GnRH1基因序列，其编码蛋白含有一个由23氨基酸构成的信号肽，为分泌蛋白和亲水性蛋白；并获得了GnRH1基因在中华鳖不同组织及不同发育时期胚胎中的表达特征，为深入了解中华鳖生长繁殖的调控机制提供理论基础。但是由于仅研究了1龄雌雄中华鳖不同组织中的表达差异，后续还需要对中华鳖GnRH1基因在不同发育阶段组织中的表达特征进行进一步的研究，以期获得与雌雄生长差异之间的关系。