铝胁迫对紫花苜蓿不同种质材料的影响及综合评价

2019-07-25许文花毕玉芬马向丽

草地学报 2019年3期

姜娜，唐敏，韩博，任健，许文花，毕玉芬*，马向丽*

(1. 云南农业大学动物科学技术学院，云南昆明 650201； 2. 云南农业大学园林园艺学院，云南昆明 650201)

苜蓿是我国最重要的豆科牧草，其种植面积广、适应性强、产草量高，并且含有丰富的营养物质，有着“牧草之王”的美誉[1]。云南20世纪80年代开始试种紫花苜蓿，仅1983年便从澳大利亚引进了苜蓿属饲草资源9个种，共计99份品种和资源，随后云南牧草工作者也陆续引入了大量的紫花苜蓿(Medicagosativa)品种[2]。但由于云南多为酸性土壤，铝毒害较为严重，导致这些资源没有得到大面积推广。随着紫花苜蓿引种和推广工作的开展，部分苜蓿资源零散生存且被保留下来，成为适用于选育耐铝性苜蓿的重要材料。本课题组前期对这些苜蓿资源进行了适生性和遗传多样性的研究[3-6]，但有关耐铝性紫花苜蓿材料的筛选以及综合影响评价报道较少。

植物的铝毒效应外在形态表现主要是根系和地上部分生长受阻。周蓉、孙文君等[7-10]研究表明，长时间铝胁迫可抑制植物的根系生长，导致根系活力下降。植物生理指标在一定程度上也反映植物在铝胁迫下的耐受性。大量研究表明，脯氨酸含量积累的多少在一定程度上反映了植物的抗逆性。在逆境条件下植物体往往会大量积累脯氨酸，积累的脯氨酸可降低细胞渗透势，维持压力势，保持和稳定大分子物质，参与叶绿素合成，维持细胞膜正常功能，并且一般情况下耐性的品种会积累较多的脯氨酸[11]。铝胁迫下植物根系分泌有机酸也是植物耐铝的一种重要的机理，是近年来国内外植物抗铝研究的热点[12]。Ryan等在同一条件下调查了 36 种耐铝能力不同的小麦品种，结果发现，根系分泌的苹果酸数量与这些品种对铝的忍耐程度间存在高度的相关性[13]。Miyasaka等发现，铝胁迫下菜豆耐铝品种根系分泌的柠檬酸比敏感品种高10倍[14]。大量的文献证据表明，铝胁迫下有机酸的分泌能够螯合AL3+，在降低其生物毒性方面具有重要作用。在众多的耐铝毒机制中，有机酸的分泌被认为是植物耐铝毒评价最重要的机制。但这些研究多集中于大作物，如小麦、玉米、水稻等，而牧草上尤其苜蓿上少有研究。

本研究采用形态学和生理学的方法，参照课题组前期研究结果，选取前期研究的三个铝浓度中最高铝浓度(100 mg·kg-1)，对27份云南紫花苜蓿资源的耐铝性进行评价，进一步鉴定和筛选出耐铝性强的苜蓿材料，为选育能够广泛适应云南大面积酸性土壤区种植的苜蓿品系提供种质资源和理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料收集和野外调查的方法

材料收集和生态调查参照白史且的[15]方法。以2007～2008年对滇西北、滇中、滇东、滇南地区收集的紫花苜蓿资源为研究材料[16]。

表1 27份云南逸生苜蓿材料的采集地点Table 1 Collection areas of 27 escaped alfalfa in Yunnan

1.2 培养及处理

栽培方法：用干净的细沙做基质，细沙用去离子水处理后烘干备用。选用容积为600 mL的塑料盆，并在塑料盆底部铺上与其底面积一样的无纺布，取生长一致、健康的生根苗经0.1%HgCl2消毒10 min，冲洗干净后均匀种于细沙中，再轻轻覆盖50 g细沙。每隔4～5 d浇Hoagland营养液。培养20 d，期间注意保持温室的通风，温度和湿度恒定，定期喷农药除虫除杂草。

铝处理：将营养液的pH调整为4.5，选用三价硝酸铝配置浓度为100 mg·kg-1铝溶液，对照处理pH 4.5，无铝的正常营养液。在第20 d天进行胁迫处理，每个处理设3次重复。栽植30 d后进行指标的测定。

1.3 测定指标及方法

株高：将植株拉直，用卷尺测量其最高点距地面的垂直距离。

脯氨酸含量：采用茚三酮显色法[17]进行测定。

根系活力：采用TTC法[18]进行测定。

有机酸含量：采用高效液相色谱法进行测定，测定苜蓿根系中草酸[19]、苹果酸[17]和柠檬酸[20]的分泌量。

为消除不同材料间本身固有的生物学特性差异，将各指标转换成相对值来衡量不同材料的耐铝性。计算公式为：指标相对值=处理测定值/对照测定值×100%。

聚类分析采用离差和平法。

综合评价采用隶属函数法进行计算：

X(u)=(X—Xmin)/(Xmax—Xmin)

(1)

X(u)=1—(X—Xmin)/(Xmax—Xmin)

(2)

式中：X(u)为隶属函数值；X为铝胁迫处理下某指标的相对值；Xmax为此指标中的最大值；Xmin为此指标的最小值。若某一指标与耐铝性呈正相关，用公式(1)，若呈负相关，用公式(2)计算[21-22]。

1.4 数据分析

利用软件SPSS 20进行数据分析，差异显著性采用Duncan检验法。用DPS v8.01进行聚类分析，以及使用Excel 2010制作图表和隶属函数分析。

2 结果与分析

2.1 铝胁迫对苜蓿株高、根系活力及脯氨酸相对含量的影响

由表2可以看出不同苜蓿材料在铝胁迫下表现不同，同一材料不同指标表现差异明显。从相对株高上来看，各材料均小于50%，说明在铝胁迫下苜蓿生长收到明显抑制。相对株高较高的材料依次为7，6，10，2，13号，较低的材料为12，29，26号，最大值为48.33%，最小值为17.50%，最低值为最高值的36.21%，差异显著(P<0.05)。从相对根系活力上来看，较高的材料依次为10，12，14，28，5，15号，较低的依次为25，23，24，21，6，20，16号材料，最大值为95.75%，最小值为43.36%，最低值为最高值的45.28%，差异显著(P<0.05)。从相对脯氨酸含量上来看，较高的材料依次为18，28，27，12号，较低的依次为21，11，9，6，16，23号材料，最大值为573.43%，最小值为126.82%，最低值为最高值的22.11%，差异较显著(P<0.05)。综合比较各材料相对株高、相对根系活力和相对脯氨酸含量发现，株高较高的材料，其根系活力和脯氨酸含量并不都呈现较高的水平，以12号材料为例，其株高较低，但根系活力和脯氨酸含量较高。不同材料各生理指标在铝胁迫下表现差异不同。

表2 铝胁迫下苜蓿的相对株高、相对根系活力以及相对脯氨酸含量变化Table2 The relative plant height,relative root activity and relative proline content of alfalfa under aluminum stress/%

续表2

注：表中同列不同小写字母表示不同苜蓿材料在铝胁迫下差异显著(P<0.05)，下同

Note:The different lowercase letters in the same column represented significant differences within the different alfalfa materials under the same aluminum concentration at the 0.05 level,the same as below

由表3可以看出，铝胁迫显著增加了供试材料紫花苜蓿有机酸的分泌。从相对草酸含量上来看，所有材料相对脯氨酸含量均大于100%，相对草酸含量较高的材料为20，15，25，12，10号，较低的材料为18，23，22，6，21，26号，其中，最大值为563.48%，最小值为104.72%，最低值为最高值18.58%，差异显著(P<0.05)。从苹果酸含量上来看，较高的材料依次为10，26，25，2，5，22，7号，较低的材料依次为27，21，28，20，24，9，8，23，6号，且均小于100%，其中，最大值为343.41%，最小值为22.10%，差异显著(P<0.05)。从柠檬酸含量上来看，较高的材料依次为25，2，5，12，13，29号，较低的材料依次为27，26，21，7，8，28，23号，且均小于100%，其中，最大值为398.70%，最小值为20.37%，差异显著(P<0.05)。综合上述分析来看，除了2号和5号材料在各指标下差异不显著外(P>0.05)，其余材料在高浓度铝胁迫下均有较大的差异(P<0.05)。

表3 铝胁迫下苜蓿相对有机酸含量的变化Table3 The relative organic acids content of alfalfa under aluminum stress/%

综合表2和表3可知，2号和5号材料在各指标下差异不显著，其余材料在高浓度铝胁迫下均有较大的差异。比较27个材料形态指标和生理指标的相对值发现，形态指标在评价耐铝性材料中虽有重要的参考价值，但不能作为孤立的参考指标存在，而有机酸含量积累的多少在此次评价耐铝性苜蓿材料中也占有十分重要的地位，应综合多指标进行材料耐铝性的评判。

2.2 耐铝性综合评价

2.2.1 苜蓿耐铝性聚类分析利用上述各生理指标指标对27份苜蓿资源进行聚类分析(图1)。

采用离差和平法可将27个紫花苜蓿材料分为三大类(Ⅰ—Ⅲ)。I类分别为2，5，30，25，12，13，14，15号，为耐铝性较强的材料，根系活力表现较高，脯氨酸和有机酸含量普遍表现较高。Ⅱ类分别为6，8，24，16，19，20，29号材料，为耐铝性适中的材料，除个别材料外，根系活力表现一般，脯氨酸和有机酸含量普遍表现中等。Ⅲ类分别为7，10，21，26，11，22，23，27，9，28，18，17号材料，为耐铝性较差的材料，根系活力表现一般，个别材料中脯氨酸含量出现较高的情况，而有机酸含量普遍表现中等，个别材料表现出较低的情况。

图1 27个紫花苜蓿材料的耐铝性聚类图Fig.1 Results from the cluster analysis of escaped alfalfa based on their performances under aluminum stress

2.2.2 耐铝性综合评价将供试苜蓿各指标隶属函数值计算出并累加得各材料的综合评价总分值，结果见表4，可以看出15号材料得分最高，29号材料得分最低。结合图1聚类分析法与表2-4综合评价得出，12，13，14，15号材料为耐铝性较强的材料，在铝胁迫下这四份材料植株高度和根系活力普遍表现较高，脯氨酸和有机酸含量积累较多。其耐铝性强弱顺序依次为：15>12>14>13号。

表4 隶属函数综合评价得分及排名Table 4 The total scores and ranks of subordinate function

3 讨论

3.1 铝胁迫处理对苜蓿生长具有明显的抑制作用

铝胁迫处理对苜蓿生长具有明显的抑制作用。多项研究表明[23-26]，植物株高和根系活力可作为植物耐铝毒鉴定的有效指标。在本试验中，株高和根系活力一定程度上反映了各苜蓿材料在铝胁迫下耐受性。本实验结果表明，株高和根系活力随着高浓度铝处理受到明显的抑制，这与Lei等[27]在铝胁迫对植物株高、根系活力的研究结果一致，铝毒降低了植物的生物量、根系活力，显著抑制根系伸长。早前，Davis等[28]研究表明，株高决定产量的65%，王水良等[28]人的研究也表示根生长情况和活力水平直接影响地上部分的生长和营养状况及产量水平。因而，相对株高和相对根系活力也直接反映了本试验供试苜蓿材料在铝胁迫下的生长性能。本试验中，不同材料的生物学特性不同，为消除不同材料间本身固有的差异性，故选取相对值衡量不同材料的耐铝性。而15，12，14号苜蓿材料其相对株高表现均不是最高，在综合评价中却排名前三，这也充分说明了植株高度在决定该材料耐受性程度上并不能作为唯一的指标，不同苜蓿材料在铝胁迫下各指标表现差异不同，应结合其他指标做出综合评判。

脯氨酸被认为是植物逆境胁迫的产物，在逆境胁迫下植物体内游离脯氨酸的增加是一个普遍现象，作为渗透调节物质，在逆境条件下的升高有利于植物对逆境胁迫的抵抗，从而在一定条件下增强植物对环境的适应性[30-31]。在本试验中，供试材料叶片的相对脯氨酸含量在高铝浓度胁迫下大量积累，这可能由于合成蛋白质受阻而导致游离脯氨酸的大量积累，与于波等[31]人研究结果一致。从本实验结果来看，苜蓿的相对脯氨酸含量均有提高，且均大于100%，说明苜蓿在铝毒害下，脯氨酸会大量积累，这与Patrícia等[33]研究报道中铝会诱导脯氨酸含量的积累结论相似，也证实了脯氨酸含量积累的多少在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗性的苜蓿也可以通过积累游离脯氨酸来减轻铝毒害，提高其耐受性。

3.2 供试苜蓿可通过根系分泌有机酸减轻铝毒害

大量证据表明，有机酸的分泌在螯合铝离子、减少根系对铝的吸收、降低其生物毒性方面具有重要作用，被认为是植物耐铝最重要的机制[14、34-35]。植物根系分泌的有机酸与其根际中的铝离子络合形成有机酸——铝复合物，如铝与柠檬酸、苹果酸、草酸等有机酸络合所形成的复合物，这些复合物对植物体的毒性较低，因此，在铝胁迫下植物根系分泌有机酸可以减轻铝的毒性、增强其对铝的忍耐能力[36]。本研究结果表明在高浓度铝处理条件下，供试材料草酸、苹果酸、柠檬酸积累量普遍增加，证实了Samacda等[37]苜蓿在铝毒害下有机酸显著积累的研究结论。同时，宫家珺[38]研究认为，高浓度铝胁迫时苜蓿生长速率迅速下降，各指标间的变化差异显著(P<0.05)。本研究结果也证实，高浓度铝胁迫下各指标变化幅度更大，大部分材料的相对有机酸含量大于100%。这可能由于高浓度铝处理时，耐受性较差的材料表现受伤害程度更大，其耐受性降低，差异性也表现更加显著(P<0.05)。

3.3 苜蓿耐铝性鉴定应进行多指标综合评价

植物的耐受性是由形态生理方面的综合变化来体现，不同植物对某一具体生理指标的耐铝性反应及耐铝性强弱表现均不一定相同，孤立的某个指标不能评价该植物的耐铝性。本试验结果表明苜蓿耐铝性可能受不同胁迫程度的影响，是其自身生理调节作用的综合反映，且铝胁迫对苜蓿的影响是多方面的，不能靠单一指标来评价。综合各指标发现，大多材料在铝胁迫下，植株表现较高的苜蓿材料，根系活力普遍表现较高，脯氨酸和其根系分泌有机酸含量也普遍表现较高。但以本研究中12号苜蓿材料为例，其株高表现较低，而根系活力表现一般，脯氨酸含量以及有机酸含量均表现较高，综合评价却排名第二。充分说明了苜蓿材料的耐受性不能单靠个别指标来评价，应参照更多的指标，因此，建立综合的评价体系十分重要。本研究鉴于耐铝性影响因素的复杂性，为了使试验结果更为客观、准确，综合铝处理下各项生理指标相对值变化规律的研究，以各指标的测定值进行耐铝性聚类分析，同时以隶属函数值综合评价，两种评价结果具有一定的相似性，结果也更为可观。而隶属函数综合评价法较聚类分析法更为直观、准确，可为今后的抗逆性材料筛选与评定提供一定的参考价值。本试验综合评价结果表明，15，12，14和13号耐铝性较强，可作为在富酸铝化土壤推广种植的苜蓿材料。